SIRT1信號通路介導咖啡因預防早產兒支氣管肺發(fā)育不良

劉 洋，董文斌，雷小平，劉興鈴，李清平，康 蘭，趙 帥，張 嬋

0 引言

隨著醫(yī)療技術的提高，早產兒存活率逐漸增加，同時，早產兒支氣管肺發(fā)育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)的發(fā)生率也隨之增加。目前認為，任何氧依賴超過28 d的新生兒即可診斷支氣管肺發(fā)育不良[1]。高氧暴露是BPD發(fā)生的重要因素。長時間暴露在高氧環(huán)境中，產生大量活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)，超過機體清除能力時，可發(fā)生DNA損傷、線粒體功能障礙、生物膜脂質過氧化，從而造成細胞功能障礙，引起組織器官的損傷[2]。沉默接合型信息調節(jié)因子2 同源蛋白1(Sirtuin1，SIRT1)是依賴NAD+(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)的去乙酰化酶，可在第734位賴氨酸上發(fā)生小泛素化樣修飾(Small ubiquitin-related modifier，SUMO)，其去SUMO修飾的過程則是由SUMO特異性蛋白酶1(SUMO-specific protease1，SENP1)來介導。SENP1去SUMO化作用可以降低去乙酰化酶活性，使SIRT1的去乙酰化減少，促進SIRT1核漿轉位，依賴caspase途徑使細胞凋亡蛋白活性增加，促進細胞凋亡[3-4]。氧化應激能提高大多數細胞的p53乙酰化水平。乙酰化p53轉錄激活其下游基因的表達，誘導細胞凋亡[5]。本課題組已證實ROS可能通過激活SENP1，使SIRT1去SUMO化作用增強，促發(fā)SIRT1核漿穿梭，乙酰化p53增加，從而導致細胞凋亡[4,6-7]。

咖啡因屬甲基黃嘌呤類藥物，非特異性腺苷受體阻滯劑，該類藥物用于預防和治療早產兒呼吸暫停已30余年，且早期咖啡因的使用能夠預防BPD的發(fā)生[8-10]，但是具體機制尚未明確。有學者發(fā)現，咖啡因可以減少人肺泡上皮細胞(A549)以及大鼠肺泡上皮細胞(MLE12)的高氧損傷[11-12]。但咖啡因預防BPD的機制以及與SENP1-SIRT1-p53的關系尚不清楚。本研究探討咖啡因對BPD的預防機制，為咖啡因臨床應用于BPD的預防提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2015年8月至2016年6月西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院新生兒科入院的65例早產兒為研究對象。納入標準：出生胎齡<32周、體重<1 500 g，生后24 h內入院，入院即診斷為新生兒呼吸窘迫綜合征。排除標準：住院時間<28 d，合并復雜先天性心臟病、先天性傳染病、溶血性疾病及其他先天畸形的早產兒。

根據吸氧濃度分為對照組(n=47)和高氧組(n=18)。對照組氧濃度(FiO2)為21%或>21%但總吸氧時間<24 h；高氧組FiO2>40%且總吸氧時間>24 h。再根據家屬意愿是否使用咖啡因，分為對照組(22例)、對照+咖啡因組(25例)、高氧組(6例)、高氧+咖啡因組(12例)。對照組、對照+咖啡因組、高氧組、高氧+對照組胎齡分別為(30.28±0.94)、(30.18±1.38)、(29.5±1.11)、(29.26±1.88)周；出生體重分別為(1 228±110)、(1 230±87)、(1 138±114)、(1 242±24) g；四組患兒胎齡、出生體重、PS使用率、呼吸機使用率、呼吸機使用時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，高氧組及高氧+咖啡因組激素使用率及使用時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。若對照組中患兒出現呼吸暫停需晚期使用(生后3 d后)咖啡因或(和)呼吸機治療則退出研究。

本研究中咖啡因的使用結合患兒病情及家屬的經濟條件，根據患兒家屬意愿使用，且本研究經醫(yī)院倫理委員會批準及患兒家屬知情同意。

枸櫞酸咖啡因的使用參照文獻[13]，入院后早期(生后3 d內)預防性使用咖啡因，首次負荷劑量為20 mg/kg(相當于咖啡因10 mg/kg) 30 min內泵入，24 h后使用維持劑量5 mg/kg(相當于咖啡因2.5 mg/kg)，每24 h進行1次緩慢靜脈輸入，若病程中出現呼吸暫停加重，可再次給予10 mg/kg，并將維持量增加20%；于校正胎齡34～36周，生后5～7 d無呼吸暫停發(fā)生，則停用。

65例早產兒中發(fā)生BPD 19例，BPD的診斷及分度參照文獻[14]：任何氧依賴(FiO2>21%)超過28 d的患兒即可診斷BPD，<32周早產兒于糾正胎齡36周時評估BPD嚴重程度，分為輕度(未用氧)、中度(FiO2<30%)、重度(FiO2≥30%或需要機械通氣、CPAP輔助通氣)。

1.2 免疫熒光技術檢測SIRT1定位 各組患兒于入院時(0 d)、7、14、28 d取臨床化驗后廢棄用血1 ml，利用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞(PBMCs)。細胞涂片和固定，滴入80 μl 0.2% TritonX-100 室溫下打孔15 min，滴加正常山羊血清工作液，滴加抗體稀釋液稀釋的兔抗人SIRT1抗體(1∶80)，4 ℃濕盒孵育過夜，避光滴加FITC標記山羊抗小兔IgG (1∶800)，37 ℃孵育1 h，DAPI 染核，PBS 洗滌3 次，抗熒光淬滅劑封片，用激光共聚焦顯微鏡檢測：紅色熒光(激發(fā)波長488 nm)反映SIRT1定位情況；DAPI所染細胞核為藍色熒光，兩種熒光合成為紫色熒光。應用Image Pro Plus中的Line profile測定細胞內紫色熒光分布，出現紫色熒光在細胞核中分布減少且出現在細胞核外緣即為發(fā)生SIRT1轉位。取8個視野，以陽性細胞數占細胞總數的構成比計算轉位率。

1.3 Western blot檢測SENP1、細胞核及細胞質中SIRT1、乙酰化p53蛋白 提取各組各時間點PBMC的胞核與胞漿蛋白(操作按說明書進行)，進行SDS-PAGE電泳，將目的蛋白轉移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉液室溫封閉1 h，加入1∶500的一抗(內參一抗終濃度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入1∶1 000二抗溫育1.5 h。TBST洗膜后加入ECL曝光液(A、B液 1∶1混勻后均勻覆蓋在整片膜上，反應2 min后曝光檢測。采用UVP凝膠圖像處理系統(tǒng)Lakworks 4.6 軟件分析目的條帶的灰度值，結果以目的條帶與內參之比表示。

2 結果

2.1 免疫熒光檢測SIRT1定位 SIRT1在細胞質及細胞核中均有表達，但以后者為主。四組中氧暴露第7、14、28天時，SIRT1的轉位率以高氧組最高，且隨氧暴露時間推移而增強；而高氧+咖啡因組在14、28 d時，SIRT1的轉位率降低。見圖1、表1。

2.2 SENP1、細胞核及細胞質中SIRT1、乙酰化p53 蛋白表達的檢測

2.2.1 四組不同時間點SENP1含量比較 第7、14、28天時，SENP1蛋白表達以高氧組最高，且隨氧暴露時間推移而增強；而高氧+咖啡因組在第14、28天時，SENP1蛋白表達降低，降低程度達對照組水平。見表2、圖2。

圖1 各組不同時間點的SIRT1轉位情況(熒光顯微鏡，400×)

2.2.2 四組不同時間點細胞核內SIRT1含量比較 第7、14、28天時，細胞核內SIRT1蛋白表達以高氧組最低，且隨氧暴露時間推移而明顯降低；而高氧+咖啡因組在第14、28天時，細胞核內SIRT1蛋白表達升高。見圖3、表3。

2.2.3 四組不同時間點細胞質內SIRT1含量比較 第7、14、28天時，細胞質內SIRT1蛋白表達以高氧組最高，且隨氧暴露時間推移而逐漸升高；而高氧+咖啡因組在第14、28天時，細胞質內SIRT1蛋白表達降低。見圖4、表4。

表1 各組PBMCs中不同時間點的SIRT1轉位率比較(%)

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，#P<0.05；△不同組別不同時間點存在交互效應

表2 各組PBMCs中不同時間點的 SENP1含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，##P<0.01；△不同組別不同時間點存在交互效應

圖2 Western blot檢測四組不同時間點SENP1含量

圖3 Western blot檢測四組不同時間點細胞核內SIRT1含量

2.2.4 四組不同時間點乙酰化p53含量比較 四組中第7、14、28天時，乙酰化p53蛋白表達以高氧組最高，且隨氧暴露時間推移而逐漸升高；而高氧+咖啡因組在14、28 d時，出現乙酰化p53蛋白表達降低。見表5、圖5。

圖4 Western blot檢測四組不同時間點細胞質內SIRT1含量

2.3 各組BPD發(fā)生率比較 對照組、對照組+咖啡因組沒有BPD發(fā)生，高氧組、高氧+咖啡因組BPD的發(fā)生率分別為83%和25%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.938，P<0.05)。見表6。

3 討論

隨著早產兒數量越來越多，胎齡越來越小，BPD的發(fā)生率越來越高。BPD在1967年由Northway首次報道并命名。隨著國內外學者研究的深入，已明確其病因是氧中毒、感染/炎癥、機械通氣在不成熟的肺組織造成的損傷及異常修復[14]。早期的高氧暴露、機械通氣所致的氣壓傷、

表3 各組PBMCs中不同時間點細胞核內SIRT1的含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，##P<0.01；△不同組別不同時間點存在交互效應

表4 各組PBMCs中不同時間點細胞質內SIRT1的含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，##P<0.01；△不同組別不同時間點存在交互效應

表5 各組PBMCs不同時間點乙酰化p53的含量比較

注：與對照組比較，**P<0.01；與高氧組比較，##P<0.01；△不同組別不同時間點存在交互效應

圖5 Western blot檢測四組不同時間乙酰化p53含量

組別例數BPD對照組220對照+咖啡因組250高氧組65(83)高氧+咖啡因組122(25)#

注：#與高氧組比較，χ2=4.938，P<0.05

容量傷都具有促炎作用，早期即迅速產生大量的炎癥因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、TNF-α，而抗炎因子IL-10的增長速度較促炎因子慢，促炎因子與抗炎因子的失衡使肺組織發(fā)生炎癥反應，肺泡及肺部毛細血管的上皮細胞纖維化，導致肺損傷，這與BPD的發(fā)生密切相關[15]。BPD的存在可以產生慢性氧依賴，部分患兒需要長期家庭氧療，且呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生率、呼吸道藥物使用率、再次住院率均高于非BPD患兒，可以出現肺功能受損[16]。因此，BPD的發(fā)生不僅使早產兒的死亡率升高，而且降低早產兒的生存質量，增加家庭負擔。

咖啡因屬甲基黃嘌呤類藥物，非特異性腺苷受體阻滯劑，通過非特異性阻斷腺苷A1及A2a受體，導致去甲腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺、乙酰膽堿與谷氨酸等神經遞質釋放[17]。在過去的30多年被用于預防和治療早產兒呼吸暫停的過程中，已發(fā)現咖啡因較氨茶堿在BPD、腹脹、心率增快、喂養(yǎng)不耐受、胃潴留的發(fā)生率低[18]。咖啡因的使用可以改善新生兒期肺功能情況，可能與咖啡因使用后可以增加對二氧化碳的敏感性，從而興奮呼吸有關，同時，咖啡因有支氣管擴張作用，可減少周期性呼吸，增加膈肌的活動，減少缺氧性呼吸抑制[19]。國外一篇Meta分析也表明，在極低出生體重兒中早期使用咖啡因(生后3 d內)有益于降低BPD的發(fā)生率，眾多回顧性資料分析也得出應用咖啡因可以降低BPD發(fā)生率的結論[8,12,20-21]。

從BPD的發(fā)病過程可見，生后7～14 d是BPD的進展階段，生后(28±7) d是確診BPD的治療階段。從本實驗結果中可以看出，高氧組中SENP1蛋白升高、細胞核中SIRT1蛋白降低，細胞質中SIRT1蛋白升高、乙酰化p53升高，結合免疫熒光結果，說明高氧可以促進SENP1表達，促進SIRT1從細胞核向細胞質中的核漿轉位，提高p53的乙酰化水平，這與目前的研究結果一致，同時印證了處于BPD的進展階段以后，這些蛋白水平的變化與BPD的發(fā)生緊密相關。

第14天、第28天，高氧+咖啡因組與高氧組比較，SENP1表達降低，細胞核中SIRT1表達升高，細胞質中SIRT1表達降低、乙酰化p53降低，結合免疫熒光結果中SIRT1的轉位率降低，說明咖啡因的使用降低SENP1表達、抑制SIRT1從細胞核向細胞質的核漿轉位，降低p53乙酰化水平，目前研究表明，細胞核中的SIRT1對機體具有保護作用，具有抗凋亡作用，而細胞質中的SIRT1則來源于細胞核中，具有促凋亡作用[22]，SIRT1是p53負調控因子，可以在K382位點催化p53的去乙酰化，使用咖啡因后，細胞核內SIRT1蛋白表達增加，使p53的去乙酰化作用增強，同時，乙酰化作用減弱，抵抗了乙酰化p53的促凋亡作用，從而在一定程度上減輕了高氧所致的肺損傷[5,23-24]。

本實驗中，在咖啡因的使用上，均采用首次負荷劑量20 mg/kg 30 min內泵入，間隔24 h后使用維持劑量5 mg/kg，但是在病程中若出現呼吸暫停加重，治療上將予以咖啡因加量，但是Tiwari等[12]已在體外實驗中證實，咖啡因在臨床使用劑量下，對細胞周期及活力沒有影響，并具有抗氧化性質，因此，臨床中咖啡因劑量的調整不會對該通路造成影響。

綜上所述，咖啡因降低高氧條件下BPD的發(fā)生率，其機制是通過降低SENP1表達、抑制SIRT1核漿穿梭、降低p53乙酰化水平，為咖啡因的使用提供了理論依據。

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