幾株芽孢桿菌的生理生化、生長和產酶特性研究

梁晶晶 ，鄭衛衛 ，趙 碩 ，張大偉 ，2*

（1.青島根源生物技術集團有限公司，山東青島 266111；2.齊魯工業大學，山東濟南 250353）

芽孢桿菌在動物上應用主要依賴其在腸道或環境中繁殖分泌消化酶、維生素或抗菌物質而達到益生的功能。同一菌株在不同生長環境中繁殖和分泌產物能力有很大差異，不同菌株之間的生長潛力和分泌產物類別同樣有較大差異。本文主要探究枯草與解淀粉芽孢桿菌的生理生化指標差異，及枯草、地衣與解淀粉芽孢桿菌低溫生長和平板上的產酶比較，以期探尋三類芽孢之間性能差異的規律，為其在動物養殖中的應用方案提供菌株性能基礎數據指導。

1 材料與方法

1.1 菌種 芽孢桿菌菌種來源見表1。

1.2 培養基 營養瓊脂培養基：取33 g營養瓊脂粉(北京陸橋)溶于1 L蒸餾水中，121℃滅菌30 min。

LB培養基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用1 mol/L NaOH溶液調節 pH為7.0，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

表1 評估的芽孢桿菌菌種來源

酪素培養基：干酪素10 g，酵母膏1 g，瓊脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液調節 pH為7.0，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

淀粉培養基：可溶性淀粉2 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，用1 mol/L NaOH溶液調節 pH為7.2，用蒸餾水定容至1 L，121℃滅菌30 min。

1.3 染色液 酸性汞試劑：HgCl215 g，濃HCl 20 mL，加蒸餾水至100 mL。

盧哥氏碘液：碘片1 g，碘化鉀2 g。先將碘化鉀溶解在少量水中，再將碘片溶解在碘化鉀中，待碘全溶后，加蒸餾水至300 mL。

1.4 試驗方法

1.4.1 生理生化指標測定 將枯草芽孢桿菌1號和3號、解淀粉芽孢桿菌1號進行7%氯化鈉生長、V-P測定、硝酸鹽還原、D-甘露醇發酵、丙酸鹽利用試驗，方法參考《GB/T 26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》。

1.4.2 生長曲線制作 從-80℃冰箱取出保種甘油管，用接種環挑取一環菌液，采用劃線法接種到營養瓊脂平板上，37℃培養至出現單菌落。從平板上挑取一環菌苔，接種到盛有100 mL LB液體培養基中，37℃、200 r/min振蕩培養12 h，作為種子。

將種子液按3%接種量接種到盛有100 mL LB液體培養基中，15℃或28℃、200 r/min連續培養24～80 h，每隔4～8 h在超凈工作臺進行取樣，采用分光光度計測定600 nm處吸光值，如菌液過濃，用純凈水進行適當稀釋，吸光值控制在0.3～0.6，用相應稀釋倍數的LB培養基作為對照。以培養時間t為橫坐標，吸光值OD600為縱坐標，制作生長曲線圖。

1.4.3 產酶性能測定 使用滅菌牙簽挑取平板上的單菌落，分別點種在酪素培養基和淀粉培養基上，37℃培養箱中培養24 h。

通過酪素培養基觀察產蛋白酶的能力，該培養基一般呈乳白色，菌株生長中產蛋白酶后菌落周圍因蛋白被分解，乳白色褪掉而呈現透明，肉眼初步觀察可見隱約的透明圈，在菌落周圍滴加適量酸性汞試劑后，未被降解的蛋白遇酸性汞試劑變性，培養基底色白色加重，透明圈會更加明顯，采用游標卡尺測量菌落及透明圈直徑的大小。

通過淀粉培養基觀察產淀粉酶的能力，該培養基一般無色透明，滴加盧哥氏碘液，輕搖平皿，使碘液鋪滿培養基表面，等待片刻，培養基中未被降解的淀粉遇碘變藍，菌落周圍淀粉被降解的的地方出現透明圈，同樣采用游標卡尺測量菌落及透明圈直徑的大小。

酶活力大小采用透明圈與菌落直徑的比值表示，比值越大，表示該芽孢桿菌產酶的活力越大。

2 結果與分析

2.1 生理生化指標測定結果 試驗結果表明，枯草1號、枯草3號和解淀粉1號三株菌都可在7%氯化鈉培養基中生長。V-P測定三株芽孢桿菌都為陽性，枯草3顏色最深。硝酸鹽還原測定中三株菌菌液濃度都較濃，紅色不易觀察，將發酵液稀釋十倍后紅色更明顯，觀察更方便，結果顯示三株菌均為硝酸鹽還原陽性。發酵D-甘露醇產酸驗證試驗表明，三株菌都可發酵D-甘露醇產酸使培養基變黃。試驗中將三株芽孢桿菌接種在丙酸鹽培養基上，經培養后其顏色均為深綠色，與對照組無顯著差異，說明三株菌都不能利用丙酸鹽。

2.2 生長曲線

2.2.1 15℃生長曲線 試驗測定了芽孢桿菌在低溫（15℃）下生長情況，每隔8 h取樣測定吸光值，共培養80 h。試驗表明，兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號在低溫條件下生長好于其余兩株枯草和地衣芽孢桿菌。隨著時間延長，枯草芽孢桿菌1號的生物量最大，在72 h OD600達到8.0，兩株解淀粉芽孢桿菌最高OD600也出現在48 h以后，最高值為3.8～4.4。枯草芽孢桿菌2號和3號在15℃下生長情況較差，48 h后才進入對數生長期，而兩株地衣芽孢桿菌生物量80 h內一直低于1.0。綜上，試驗中兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號相較于其他四株芽孢桿菌更能耐受低溫，較適宜在低溫水產養殖水體應用（圖1和圖2）。

圖1 枯草芽孢桿菌15℃生長曲線

圖2 地衣和解淀粉芽孢桿菌15℃生長曲線

2.2.2 28℃生長曲線 芽孢桿菌在28℃下生長較為迅速，所評估的7株芽孢桿菌都在4 h內進入對數生長期，24 h即可到達穩定期，生長明顯快于低溫下。但研究表明，枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌28℃下最高OD600值均低于15℃，因此，同一株菌28℃時最高生物量不一定高于15℃。地衣芽孢桿菌在低溫下生長最差的狀態，在28℃下長勢甚至好于解淀粉芽孢桿菌和部分枯草芽孢桿菌（圖3和圖4）。

圖3 枯草芽孢桿菌28℃生長曲線

圖4 地衣和解淀粉芽孢桿菌28℃生長曲線

2.3 產酶性能測定結果 試驗表明，這7株芽孢桿菌都能在酪素培養基以及淀粉培養基上生長并分解蛋白或淀粉，加入相應指示劑后出現透明圈。通過透明圈與菌落直徑比值可知，這7株芽孢桿菌產蛋白酶能力由大到小排序為：解淀粉2＞解淀粉1＞枯草2＞枯草3＞地衣1＞地衣 2＞枯草1；產淀粉酶能力大小排序為：解淀粉2＞枯草3＞解淀粉1＞枯草1＞枯草2＞地衣2＞地衣1。可以發現解淀粉芽孢桿菌2號產兩種胞外酶能力最強，兩株地衣芽孢桿菌產酶能力不占優勢（表2）。

表2 芽孢桿菌產酶能力測定結果

3 討論

研究表明，枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA同源性較高，通過簡單的測序鑒定也無法準確確定種屬，需通過特性基因進行分析確定。盧娟等（2013）利用基因yyaR、tetB在解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中排列順序的差異，利用引物yyaR-F/tetB-R對疑似解淀粉芽孢桿菌菌株進行了分類鑒定。湯際亮等（2013）根據生理、生化反應和菌株gyrB基因序列鑒定了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，表明試驗獺兔個體盲腸中解淀粉芽孢桿菌的數量多于枯草芽孢桿菌。劉勇等（2010）根據枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列，設計了特異引物，通過特異PCR方法對33株枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進行有效的鑒定區分。本研究結果顯示，通過簡單生理生化指標無法區分枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，與董靖等（2016）的結論一致，表明在解淀粉芽孢桿菌的工業化生產中需結合特性基因進行亞種鑒定。

生長曲線是描述生物生長繁殖變化的曲線（王宏偉，1994），其可反映細菌在不同的培養條件下所表現出的生長規律和繁殖特點，細菌生長曲線的繪制方法有很多，有血細胞計數法、活菌計數法、稱重法、分光光度法等。在嚴格控制培養條件的前提下，可通過測定培養液的OD值判斷細菌是否進入對數生長期及細菌生物量變化（何嵐等，2017）。本研究結果顯示，溫度對芽孢桿菌的繁殖影響很大，28℃時4 h內即進入對數生長期，15℃時24 h后才進入對數生長期；同一溫度下三種菌之間及不同亞株之間生長情況差異顯著 （P≤0.05）；研究發現15℃生長不好的地衣芽孢桿菌在28℃下卻生長較好，所評估的所有枯草和解淀粉芽孢桿菌28℃時最高生物量均低于15℃。綜上說明，要在某一特定動物或環境飼喂或使用芽孢桿菌制劑，需提前對其生長繁殖規律進行探究，以免因環境不適宜造成繁殖較差而起不到效果。此外，在15℃下應用芽孢桿菌可加大使用量，縮短其進入對數生長期的時間，但一旦繁殖起來，投加頻率卻不一定比溫度高時頻繁。

產生多種酶、促進動物對飼料營養的消化吸收是益生芽孢桿菌發揮益生作用的機制之一，有研究表明，枯草芽孢桿菌對動物日糧的消化效果明顯優于地衣芽孢桿菌（陶榮霞，2012）。對芽孢桿菌產酶特性的研究可采用模擬消化法（劉秀俠等，2017；程德勇等，2014）和平板透明圈法（程德勇等，2014；徐良玉，2003）。本文采用平板透明圈法比較了待測芽孢桿菌的產蛋白酶和淀粉酶能力，結果顯示在產酶方面除枯草3號的產淀粉酶能力較突出外，參與測試的其他枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產兩種酶能力相近，均不及解淀粉芽孢桿菌。本研究以酪素作為蛋白、以可溶性淀粉（α-淀粉）作為淀粉進行分解蛋白和淀粉性能評估，結果表明解淀粉芽孢桿菌性能最優，但因不同飼料原料所含蛋白、淀粉的種類不同，對具體原料的分解效果需進一步進行評估。

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