竹蓀連作土壤拮抗細菌的分離鑒定及抑菌活性

張月珠 蔣文靜 常穎萃 牛蓉 葉舟

摘 要 通過分離鑒定竹蓀連作土壤中拮抗細菌，研究其抑菌作用。采用稀釋平板涂布法，通過形態、生理生化特性及16S rDNA測序分析等方法分離、鑒定竹蓀菌拮抗細菌，用平板對峙試驗探究該菌對竹蓀菌絲生長的抑制作用。結果表明，從竹蓀連作地土壤中分離出1株對竹蓀菌絲生長具有明顯抑制作用的菌株。經鑒定，該菌株為巨大芽孢桿菌。平板對峙試驗表明，該菌及其發酵液均對竹蓀菌絲生長具有抑制作用，抑制率分別為58.37%、64.81%，而經高溫滅菌和過濾膜除菌后的發酵液對竹蓀菌絲生長的抑制率大大降低，說明發酵液所產生的抑菌物質可能是一種對高溫敏感的蛋白質，該結論為竹蓀連作障礙的全面解析提供理論依據。

關鍵詞 竹蓀 ；巨大芽孢桿菌 ；抑菌活性 ；連作障礙

中圖分類號 S482.7 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.01.016

Abstract This study screened out antagonistic bacteria in continuous cropping soil of dictyophora and analyzed its antibacterial activity. The bacteria were isolated by plate dilution method and the strains were identified by microscopic observations， biological identification and 16S rDNA sequence analysis. The plate confrontation test were used to analyze the anti-microbial activity.The results showed that there was one bacteria showed great antibacterial activity on dictyophora. The bacteria was Bacillus megatherium. The plate confrontation test showed that Bacillus megatherium and its fermentation broth had inhibiting effect on the growth of dictyophora with the efficacy of 58.37% and 64.81%. However， biological inhibition was greatly declined when the fermented liquid was sterilized with high temperature and aseptic filtration.The antibacterial was a kind of protein which was sensitive to the high temperature. This paper could provide theoretical basis for the consecutive monoculture problems of Dictyophora.

Keywords Dictyophora echinovolvata ； Bacillus megatherium ； anti-microbial activity ； consecutive monoculture problem

竹蓀（Dictyophora）屬于真菌，是對竹蓀屬（Dictyophora Desv）的總稱，別名竹笙、竹菌、竹參、網紗菇、竹簽，為名貴的食用菌。近年來，福建、湖南、貴州等省的竹蓀栽培生產發展迅速，栽培規模不斷擴大，產量不斷提高，竹蓀栽培已成為當地特色產業和重要經濟來源。但連作障礙問題使得二茬竹蓀產量下降，持續連作減產幅度更大，嚴重影響竹蓀產業的發展。

農作物連作障礙一般為諸多因素綜合影響的結果[1]。首先，土壤的肥力與農作物的產量和品質存在著密切的關系[2]。其次，作物生長過程中，根系常會分泌對自身有害的化合物[3-4]，且長期連作，根系的微生物群落會發生變化或者結構被打破，病原微生物數量增加，影響作物的正常生長與發育[5-8]。因食用菌栽培生產連作障礙的特點、發生機制有別于植物連作障礙，竹蓀連作土壤中是否存在竹蓀菌的拮抗細菌，竹蓀菌與土壤拮抗細菌的互作是否為竹蓀連作障礙的重要原因，目前都尚未見相關研究。但在某些地區，連作障礙問題已嚴重影響食用菌產業的健康發展。本文通過對竹蓀連作土壤竹蓀菌拮抗細菌的分離鑒定及抑菌作用進行研究，探討竹蓀連作土壤拮抗細菌與竹蓀菌的互作關系，旨在為竹蓀連作障礙的全面解析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 竹蓀連作土壤樣

2009年4月，采集福建省南平市順昌縣大歷鄉竹蓀產區連作地塊土壤樣，采樣深度5～15 cm。采樣后立即將土壤樣帶回實驗室風干，過2 mm篩，4℃保存備用。

1.1.2 供試竹蓀菌株

棘托竹蓀89 菌株：由福建農林大學菌草研究所提供。

1.1.3 培養基

采用LB固體培養基分離純化巨大芽孢桿菌；采用LB液體培養基進行巨大芽孢桿菌發酵培養；采用PDA培養基進行竹蓀菌培養及與巨大芽孢桿菌的平板對峙試驗。

1.2 方法

1.2.1 竹蓀菌拮抗細菌的分離純化

稱取20 g土壤樣品，加入盛有100 mL無菌水的三角瓶中（含玻璃珠），l40 r/min振蕩20 min，靜置。取1 mL上清液，系列稀釋至1×l0-9，將梯度稀釋好的上清液進行平板涂布，并置于37 ℃培養箱中培養2～3 d，挑取單菌落，平板劃線法純化，純菌株移入斜面，保存備用。以竹蓀菌為指示菌，將分離的細菌菌株采用平板對峙生長法進行拮抗性篩選，選出對竹蓀菌生長有抑制作用的菌株，保存備用。

1.2.2 菌株的初步鑒定

將篩選獲得的菌株接種在LB培養基上，28℃培養48 h后，觀察菌落形態。革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態。對該菌株進行過氧化氫酶反應、甲基紅試驗、吲哚試驗、卵黃試驗、淀粉水解、葡萄糖發酵等生理生化試驗[9]。

取適量的培養菌落，提取DNA，根據細菌的16S rDNA核苷酸系列引物，進行PCR擴增，測序，并與BLAST進行比對。

1.2.3 拮抗細菌發酵液的制備

將竹蓀菌拮抗細菌接種于裝有150 mL LB液體培養基的三角瓶中，37℃ 120 r/min培養24 h后，發酵液于4℃沉淀24 h。一部分發酵液高壓滅菌（121℃，0.1 MPa）處理20 min，作為高溫處理拮抗細菌發酵液；另一部分用0.22 μm的細菌濾膜去菌體，作為無細胞拮抗細菌發酵液[10-11]。

1.2.4 竹蓀菌拮抗細菌發酵液蛋白粗提液的制備

將已活化的竹蓀菌拮抗細菌接種于LB液體培養基中，37℃120 r/min培養20 h，4℃ 8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入固體硫酸銨至飽和，4℃沉淀24 h，10 000 r/min離心10 min，棄除上清液，取沉淀用5 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 6.0）懸浮[12-13]。

1.2.5 竹蓀菌拮抗細菌對竹蓀菌絲生長影響的測定

采用平板對峙培養法，用直徑為6 mm的打孔器取生長良好的竹蓀菌菌塊，接入PDA平板一側，于24 ℃恒溫培養箱中培養3 d。取培養后生長良好的竹蓀菌，在距竹蓀菌塊邊緣2 cm 處劃線接入活化24 h 的竹蓀菌拮抗細菌，不接竹蓀菌拮抗細菌為對照，3次重復。24℃恒溫繼續培養，待竹蓀菌長到培養皿邊緣時，測定抑菌寬度，計算抑菌率（ 抑菌寬度用十字交叉劃線法測量）[14]。

抑菌率=[（對照竹蓀菌菌落直徑-處理竹蓀菌菌落直徑）/對照竹蓀菌菌落直徑]×100%[15]

1.2.6 竹蓀菌拮抗細菌發酵液對竹蓀菌絲生長影響的測定

采用平板對峙培養法，在各PDA平板上分別放置一個無菌的牛津杯，在距離牛津杯2 cm 處接種竹蓀菌塊（d=6 cm），將竹蓀菌拮抗細菌發酵液、過濾除菌發酵液、高溫滅菌發酵液各150 μL 分別加入牛津杯中，以牛津杯中加入無菌水作為對照，設置3個重復，于4℃冰箱中放置12 h 后，置24 ℃恒溫培養箱中培養，待對照組菌絲長至平板邊緣時，測定抑抑菌寬度，計算抑菌率[16]。

1.2.7 竹蓀菌拮抗細菌發酵液蛋白粗提液對竹蓀菌絲生長的影響

采用平板對峙培養法，在各PDA平板上分別放置一個無菌的牛津杯，在距離牛津杯2 cm 處接種竹蓀菌塊（d=6 cm），在牛津杯中加入竹蓀菌拮抗細菌發酵液的蛋白粗提液150 μL，以牛津杯中加（NH4）2SO4飽和的5 mmol/L磷酸緩沖溶液作為對照，設置3個重復，在4℃冰箱中放置12 h 后，24℃恒溫培養，待對照組菌絲長至平板邊緣時，測定抑菌寬度，計算抑菌率[17]。

2 結果與分析

2.1 竹蓀菌拮抗細菌的鑒定

竹蓀菌拮抗細菌的菌落形態為：灰白色，圓形，邊緣不規則，干燥，有皺褶，不透明，菌落直徑1～2 cm。菌體桿狀，革蘭氏染色反應陽性。

試驗生理生化結果見表1。查閱伯杰細菌鑒定手冊（第八版），表明該菌與巨大芽孢桿菌的生理生化特性的描述完全相同。結合菌株形態特征，初步認定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus magaterium）。

拮抗細菌16S rDNA的PCR擴增結果如圖1所示。圖1表明，擴增的16S rDNA條帶約為1 500 bp，符合理論預期值。說明該條帶具有高專一性，得率高，能用于直接測序，并與BLAST進行比對。同源性分析結果表明，該菌株的16SrDNA 序列與多種Bacillus megaterium的16S rDNA序列相似性高達99%以上，結合該菌形態學和生理生化特性，鑒定該菌株為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，Accession AB697153.1）。

2.2 巨大芽孢桿菌對竹蓀菌絲生長的影響

圖2表明，巨大芽孢桿菌對竹蓀菌絲的生長有明顯的抑制作用，接種了巨大芽孢桿菌的PDA平板上的竹蓀菌絲長勢明顯弱于未接種巨大芽孢桿菌的PDA平板，抑制率為58.37%。

2.3 巨大芽孢桿菌發酵液對竹蓀菌絲生長的影響

表2可知，未除菌的巨大芽孢桿菌發酵液對竹蓀菌絲生長具有明顯的抑制作用，抑制率為64.81%，過濾除菌發酵液、高溫滅菌發酵液對竹蓀菌絲的生長沒有明顯的抑制作用。

2.4 巨大芽孢桿菌發酵液蛋白粗提液對竹蓀菌絲生長的影響

由圖3可知，巨大芽孢桿菌發酵液蛋白粗提液對竹蓀菌絲的生長有抑制作用，其抑制率達到55.9%。

3 討論

具有一定的抑真菌作用為自然土壤的重要功能之一，包含非常復雜的作用機制[18]。吳敏娜等[19]認為，土壤抑真菌作用與細菌群落結構存在密切的關系。也有學者認為，土壤中存在可直接分泌抗真菌物質的微生物，或存在能誘導或促進抗真菌微生物產生更多有效物質的種群[20-22]。還有研究認為，影響土壤抑制真菌的因素之一為土壤細菌種群多樣性[23]。

已有的研究表明，巨大芽孢桿菌菌株在生物防治方面已發揮重要作用。曹燕魯等[17]發現，Bacillus megaterium B1301對有害真菌具有拮抗作用。推測土壤中棲息的某些巨大芽孢桿菌菌株可能與土壤抑真菌作用具有密切關系。

本文從竹蓀連作地土壤中分離得到一株對竹蓀菌生長具有明顯抑制作用的菌株，經鑒定為巨大芽孢桿菌。過濾除菌表明，巨大芽孢桿菌代謝產物中粒徑小于0.22 μm的小分子物質對竹蓀沒有明顯的抑制作用，未除菌的巨大芽孢桿菌發酵液對竹蓀菌絲生長具有明顯的抑制作用，發酵液蛋白粗提液對竹蓀菌絲的生長也具明顯的抑制作用，但對照液也在一定程度上延緩了竹蓀的生長，使得竹蓀菌絲橫向上的生長受到明顯的抑制，但在縱向上仍能生長，因此除巨大芽孢桿菌發酵液產生的抑菌蛋白外，其他抑制竹蓀菌絲生長的因素還需要進一步驗證。

有研究表明，竹蓀連作土壤中的微生物區系、土壤物質組成以及酶活力都發生明顯變化。種植竹蓀初期，新地和連作地細菌總量、真菌總量差異不大，但生長至出菇盛期，連作地細菌總量增幅超過新地，新地真菌總量增幅遠遠超過連作地，連作使竹蓀菌和土壤真菌都受到抑制，結合本實驗結果，說明土壤物質組成變化可能促進了土壤巨大芽孢桿菌及其他細菌的生長，抑制了竹蓀菌及其他土壤真菌的生長。巨大芽孢桿菌代謝物的累積，尤其是對竹蓀生長具有抑制作用的代謝物蛋白質抑制了竹蓀的生長。其次，竹蓀生長過程中，竹蓀菌及其代謝物、土壤微生物及其代謝物共存于種植土壤這個復雜的物質組成體系，隨著連作年限的增加，導致土壤微生物群落結構發生變化，影響竹蓀菌的生長。這可能都是造成連作障礙現象的原因。

總之，竹蓀連作障礙的形成機制復雜，僅從本研究的結果判定土壤巨大芽孢桿菌所產蛋白是造成竹蓀連作障礙的主要原因尚不夠充分，下一步工作將應用土壤復雜體系未知物非歧視分析技術，使用竹蓀生長趨勢圖分析技術，聯系實際生產，研究特征代謝物群對竹蓀菌生長的影響。

參考文獻

[1] 姜超英，潘文杰. 作物連作的土壤障礙因子綜述[J]. 農學學報，2007（03）：26-28.

[2] Mithofer A. Suppression of plant defence in rhizobia-legume symbiosis [J]. Trends in Plant Science， 2002， 7（10）： 440-444.

[3] Blum U， Shafer S R， Lehmen M E. Evidence for inhibitory allelopathic interactions involving phenolic acids in field soils： Concepts vs. an experimental mode1[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1999， 15（5）： 673-693.

[4] 黃錦鵬，劉 洪，魏晉賢. 地黃連作障礙機制研究進展[J]. 南方農業，2016，10（06）：29-30.

[5] Yang C H， Crowley D E， Menge J A. 16SrDNA fingerprinting of rhizosphere bacterial communities associated with healthy and phytophora infected avocado toots[J]. FEMS Microbiology Ecology， 2001， 35（2）： 129-136.

[6] 范延輝. 根際促生菌及其在防治連作障礙中的應用[J]. 天津職業院校聯合學報，2008，10（2）：33-35.

[7] 馬云華， 魏 珉，王秀峰. 日光溫室連作黃瓜根區微生物區系及酶活性的變化[J]. 應用生態學報，2004，15（6）：1 005-1 008.

[8] 王 燦，李志剛，楊建峰. 胡椒連作對土壤微生物群落功能多樣性與群落結構的影響[J]. 熱帶作物學報，2017，38（7）：1 235 -1 242.

[9] Buchanan R.E. 伯杰細菌鑒定手冊（第八版）[M]. 北京：科學出版社，1984

[10] 暴增海，馬桂珍，楊文蘭，等. 生防細菌BMY-1對幾種植物病原真菌的抑制作用[J]. 中國植保導刊， 2005，25（11）：5-7.

[11] 陳林鳳，范詠梅，郝敬喆，等. 三種生防細菌對新疆灰霉病菌（Botrytis cinerea）的拮抗作用[J]. 新疆農業科學，2009，46（6）：1 252-1 257.

[12] 魯子賢. 蛋白質化學[M]. 北京：科學出版社，1981.

[13] 王建偉. 小麥赤霉病菌拮抗菌的分離鑒定、發酵條件的優化及抗菌物質的研究[D]. 南京：南京農業大學，2010.

[14] 孫曉東，余鳳玉，宋薇薇，等. 一株新型Bt菌株的鑒定及其抗椰子莖瀉血病菌和殺小菜蛾活性[J]. 熱帶作物學報，2015，36（5）：961-965.

[15] 暴增海，李 一，曹冬陽. 拮抗細菌BMY-1菌株對幾種水果儲藏病原真菌的抑制作用[J]. 北方園藝，2007（3）：39-41.

[16] 章四平，匡 靜，王建新，等. 生防菌株NJ—18的鑒定及其對幾種植物病原真菌的拮抗作用研究[J]. 中國農學通報，2009，25（3）：213-217.

[17] 曹燕魯，吳 瓊，劉 矯. 巨大芽孢桿菌B1301分泌物的抑菌作用及其特性的研究[J]. 齊魯工業大學學報，2004，18（2）：51-55.

[18] Dobbs C G， Hinson W H. A Widespread Fungistasis in Soils[J]. Nature，1953，172（4 370）： 197-199.

[19] 吳敏娜，張惠文，李新宇，等. 土壤抑真菌作用與細菌群落結構的關系[J]. 應用生態學報，2008（07）：1 574-1 578.

[20] Lutz M P， Wenger S， Maurhofer M， et a1. Signaling between bacterial and fungal biocontrol agents in a strain mixture[J].FEMS Microbiology Ecology， 2004（48）： 447-455.

[21] Maurhofer M， Baehler E， Notz R， et a1. Cross talk between 2，4-diacetylphlorogiucinol producing biocontrol pseudomonads on wheat root[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2004（70）： 1 990-1 998.

[22] Siddiqui I A，Shaukat S S. Mixtures of plant disease sup， pressive bacteria enhance biological control of multipie tomato pathogens[J]. Biology and Fertility . 2002（36）： 260-268.

[23] 吳敏娜，張惠文，李新宇，等. 提取北方土壤真菌DNA的一種方法[J]. 生態學雜志，2007，26（4）：611-616.