推拿手法對頸椎病家兔骨骼肌ATP mRNA表達的影響

王志強，竇思東，林麗莉，毛忠清，陳炬烽

（福建中醫藥大學針灸學院，福建 福州 350122）

長期低頭位引起的頸椎動力性平衡——頸項部肌肉的功能異常是頸椎病發病的主要病因。在頸椎病發生發展過程中，頸背部肌張力異常升高、肌力減弱、動力性失衡，逐漸引起脊柱靜力系統（椎體及附件、椎間盤和相連韌帶）失衡，形成惡性循環，是頸椎病發病的關鍵所在［1］。頸部肌肉的損傷既是頸椎病發病的一個重要病因，也是該病重要的癥狀體現，因此探討其病變肌肉的病理變化情況，對揭示頸椎病的發病機制和治療機理具有重要的意義。推拿手法是臨床保守治療頸椎病的有效手段［2-3］，該療法直接作用于肌肉，其起效過程必然與其對肌肉的影響存在密切聯系。故我們采用低頭位法制備頸椎病家兔模型，觀察推拿手法對肌張力及骨骼肌三磷酸腺苷酶（ATP）mRNA表達的變化，探討手法治療頸椎病的內在機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 日本大耳白家兔40只，雌雄各半，體質量（2.30±0.16） kg，6～7 月齡，購自福建醫科大學動物實驗中心。

1.2 主要試劑和儀器 頸復康顆粒（承德頸復康藥業股份有限公司，批號：710065）；RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒（康為世紀生物科技有限公司，批號：0051501、00041501、0031505）；PCR 引物（南京金斯瑞生物科技公司）；7500 Fast熒光定量PCR儀 （美國Applied Biosystems公司）；Nano Drop 2000超微量核酸測定儀（美國Thermo公司）；ST 16R高速冷凍離心機（美國Thermo公司）；XW-80A微型漩渦混合儀 （上海滬西分析儀器廠）；TPA-2型智能推拿手法參數測定儀（由上海中醫藥大學和復旦大學共同開發研制）；SA7550肌電圖誘發電位儀（加拿大flexcomp infiniti公司）。

2 實驗方法

2.1 造模與分組 按體質量編號，根據分層隨機原則，利用SPSS 19.0統計軟件的Proc Plan過程隨機化將兔子按1∶3比例分為正常組和造模組，先將造模組環境適應性訓練3 d，采用低頭位法造模：每天將動物固定于特定的兔架上，使其頸椎處于低頭屈曲45°的異常應力環境下，每日5 h，連續操作12周。以表面肌電檢測張力顯著變化作為造模是否成功的客觀標準。造模結束后將造模組隨機分為模型組、藥物組、推拿組各10只。

2.2 干預 造模后第2天完成表面肌電檢測后進行相應干預。其中藥物組按1 g／（kg·d）予頸復康顆粒進行灌胃。推拿組采用一指禪推法［4］在家兔大椎穴上吸定操作，手法的輕重頻率通過TPA-2型智能推拿手法參數測定儀標定，在前期已由專人按手法要求訓練達標，一指禪手法操作參數：頻率120次／min，每次治療15 min，每日1次。藥物組、推拿組均干預10 d，正常組和模型組無干預治療。

2.3 取材 實驗結束后，稱量家兔體重，各組家兔腹腔注射3%戊巴比妥鈉25 mL／kg經耳緣靜脈注射麻醉，解剖家兔迅速取出兩側后斜方肌，4℃預冷的生理鹽水清洗，濾紙吸干肌肉組織表面的水分并稱重，計算家兔指數（斜方肌質量／體質量），將一側肌肉立即投入4%中性甲醛固定液中固定，另一側肌肉液氮速凍，-80℃冰箱保存。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 表面肌電檢測 分別于造模完成第2 d及干預后進行表面肌電的檢測，并提前1 d對家兔后斜方肌周圍進行剃毛備皮處理。在電極片上涂抹好導電膏，正、負極與參考電極呈正三角形分布，每個電極中心點距離2 cm，正負極順著受檢肌肉的肌纖維軸向放置，將其固定于后斜方肌上；接通肌電信號收集器，采用2通道的Rms+三維頻譜的通道，背景參數高通濾波器設置在10～20 Hz，低通濾波器設置在400～450 Hz，開始收集肌電信號，待信號平穩后截取靜息階段數據，觀察其波幅變化。

2.4.2 ATP mRNA檢測 采用熒光定量PCR方法測定，以GAPDH為內參。將RNA提取后，逆轉錄合成cDNA。 配制 10 μL 反應體系：dNTP Mix 2 μL，Primer Mix（引物）1 μL，RNA 模板 4.5 μL，5×RT Buffer 2 μL，SuperQuickRT Mix 0.5 μL，而后渦旋震蕩混勻，短暫離心，37℃孵育15 min，85℃孵育5 s；反應結束后短暫離心，所得的cDNA可放在-20℃長期保存。最后進行熒光定量PCR檢測：① 配制25 μL反應體系。完成之后，短暫離心；② 進行PCR反應程序：采用三步法（變性，退火，延伸）擴增循環。每個樣本做3個復孔，將3個復孔得到的Ct值取平均，并根據2-ΔΔCt計算出mRNA相對表達量。

2.5 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件對所有數據進行處理。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 4組干預前后肌張力比較 見表1。

表1 4組干預前后肌張力比較（x±s） μV

3.2 4組ATP mRNA表達水平比較 見表2。

表2 4 組 ATP mRNA 表達水平比較（n＝3，x±s）

4 討 論

流行病學調查表明，不良的勞動姿勢是職業性肌肉骨骼損傷的一個重要因素，其中最主要的是強迫體位的影響［4］，而強迫屈頸體位是頸椎病發病的危險因素之一。強迫體位使機體產生的靜態負荷容易引起肌肉疲勞，血液循環減弱，可致組織缺血，代謝產物清除減慢，長時間可造成肌肉損傷。當肌肉疲勞時，它的肌電一般表現為肌纖維的興奮傳導速度減慢，波幅一般有一定的增加。我們的實驗表明：造模12周后，家兔肌電圖表現出了肌源性損害，肌張力顯著增高，經過藥物或推拿治療后，家兔的肌電圖征象明顯好轉，且推拿組波幅降低程度明顯高于藥物組，提示推拿對頸椎病肌張力的改善效果顯著優于藥物治療。

肌肉組織由于長期缺血缺氧，線粒體功能障礙，ATP生成不足，我們的實驗結果也觀察到了這類現象，這使依賴于 ATP供能的各類酶活性下降［5］。再者，因代謝產物的減慢，導致自由基生成增加，而自由基也是酶損傷的重要因素，可導致其活性下降［6］。 Na＋-K＋-ATP 酶活性下降主要使細胞膜電位紊亂，Ca2＋-ATP酶活性下降導致細胞內鈣超載激惹一系列代謝紊亂，兩者均可致結構退變，甚至喪失生命力［7］。而整個肌細胞的損傷，最終導致骨骼肌損傷。椎后肌肉如若不能正常調節頸椎動力學平衡，導致動力系統失衡，進一步引起頸部椎體-韌帶-椎間盤組織構成的靜力平衡系統的失衡，最終導致整個頸椎系統生物力學功能的紊亂，使頸椎穩定性喪失，出現頸椎間盤的退變而發病。在這個病變過程中，我們的研究結果提示：及早進行推拿手法治療能有效提高ATP酶mRNA的表達，有助于促進ATP酶的合成和活性，從而減輕或者避免肌細胞的損傷，進而有利于頸椎動力系統平衡的恢復。在下一步的實驗中，我們將深入觀察推拿手法對該疾病病理過程中ATP酶合成和活性的影響。

綜上所述，實驗研究結果提示：① 手法能有效改善頸椎病的高張力狀態，顯著降低肌張力；表面肌電在一定程度上能有效反映頸椎病的疾病狀態和治療效果，可以作為臨床頸椎病評價的一種客觀指標。②作為臨床頸椎病保守治療的常用手段，手法治療頸椎病療效顯著，這與手法能顯著促進頸椎病骨骼肌ATP酶mRNA的表達，促進ATP酶的合成和活性，挽救肌細胞，存在一定的相關性，其內在機制有待進一步深入研究。③本次選用的一指禪推法具有刺激舒適、滲透性強等優勢，易于被患者所接受，配合大椎穴激發陽氣，通督扶陽，把手法和穴位扶助陽氣的作用結合取得了顯著的效果，這種效果我們將在下一步臨床實驗中加以驗證。

［1］ 王擁軍.施杞教授關于頸椎病理論與臨床的探討［J］.中國中醫骨傷科雜志，1997，5（3）：60-62.

［2］ 王昊，左偉斌，張慧，等.推拿對慢性神經根型頸椎病疼痛相關腦區的影響［J］.中國中醫基礎醫學雜志，2017，23（6）：854-857，860.

［3］ 許軍，顧非，劉鯤鵬，等.三步推拿法治療頸型頸椎病臨床推廣應用研究［J］.天津中醫藥，2018，35（1）：25-27.

［4］ 王起恩，王生，牛云彤，等.強迫體位致骨骼肌線粒體動態變化的研究［J］．中華勞動衛生職業病雜志，1996，14（3）：142-144.

［5］ 徐建廣，顧玉東，李繼峰.缺血對失神經肌肉超微結構及酶組織化學的影響［J］.中華實驗外科雜志，2003，20（6）：499-500.

［6］ 吳小春.自由基與鈉鉀 ATP酶的損傷［J］.國外醫學（臨床生物化學與檢驗學分冊），1991，12（2）：54-58.

［7］ 沈燕國，徐建光，顧玉東，等.人體失神經支配骨骼肌 Na，KATP酶、Ca-ATP酶及糖原的變化［J］.復旦學報（醫學版），2002，29（5）：343-346.