健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK mRNA的調控作用

林麗瓊，林 煜，肖莉莉，馮爾宥，王武煉，張怡元

（廈門大學附屬福州第二醫院，福建 福州 350007）

人工關節置換術是治療終末期關節疾病成功有效的方法，假體周圍骨溶解是引起人工關節假體無菌性松動、關節置換術中晚期失敗的最主要原因［1］。假體磨損表面釋放顆粒誘發炎性反應，促進破骨細胞活化成熟，引起假體周圍骨溶解吸收［2］。目前無法完全避免假體材料產生磨損顆粒，缺乏有效的預防手段，因此尋找防治假體周圍骨溶解的藥物是降低假體松動發生率的研究難點及熱點。OPG／RANKL／RANK系統是參與骨溶解的核心信號通路［3］，成骨細胞表面分泌核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of NF-кB ligand，RANKL）可與破骨細胞或破骨前體細胞表面的核因子-κB受體活化因子（receptor activator of NF-кB，RANK）結合，促進破骨細胞的分化成熟，并抑制其凋亡；成骨細胞分泌骨保護素（osteoprotegerin，OPG）可競爭性結合RANKL，阻止RANKL與RANK的結合，從而阻斷骨溶解信號通路，起骨保護作用。前期研究表明，健骨顆粒含藥血清可抑制體外成骨樣細胞RANKL mRNA表達，促進OPG mRNA表達，競爭性結合RANKL，抑制骨吸收信號的傳遞，抑制破骨細胞的生成、活性，從而抑制骨吸收［4-5］。本實驗通過研究健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系統相關因子的影響，以期為其防治人工關節無菌性松動提供實驗基礎。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級3月齡雄性SD大鼠40只，體質量（290±20）g，由福建醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（閩）2012-0001，飼養于福建省中醫藥研究院比較醫學中心，合格證號：醫動學第23-016號，實驗動物自由飲水進食。

1.2 實驗藥物 健骨顆粒由煅狗骨、淫羊藿、黨參、山茱萸、淮山藥等藥物組成，原藥材購自福建省藥材公司，由福建省中醫藥研究院試車間加工制備，每克健骨顆粒含生藥2.9 g。

1.3 實驗試劑 鈦顆粒（瑞士普魯斯外科植入物有限公司）；水合氯醛、多聚甲醛（國藥集團化學試劑有限公司）；HE染液（北京索萊寶科技有限公司）；TRIzol（美國 invitrogen 公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 Takara 公司）；SYBRTMPremix Ex TaqTM（日本Takara公司）。

1.4 實驗儀器 TS-12U生物組織脫水機、BM-VⅡ石蠟包埋機（孝感亞光醫用電子技術有限公司）；RM2235石蠟切片機、DM4000B正置顯微鏡（德國Leica公司）；Infinite M200酶標儀（瑞士Tecan公司）；2 000超微量分光光度計（美國 Nanodrop公司）；S1000PCR擴增儀（美國BIO-RAD公司）；7 500 Fast熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 鈦顆?；鞈乙褐苽?磨損顆粒采用鈦顆粒，平均直徑小于10 μm。將鈦顆粒置于180℃烤箱6 h，70%乙醇浸泡48 h，PBS洗滌，梯度離心，無水乙醇浸泡24 h，沉淀鈦顆粒，去除無水乙醇后自然干燥，精密天平分裝成30 mg／包，高壓蒸汽滅菌30 min，60℃恒溫箱烘干后，4℃保存備用。鈦顆粒通過內毒素檢測試劑盒檢測鈦微粒內毒素＜0.25 Eu／mL。臨用前加入生理鹽水配置成10 mg／mL的鈦顆?；鞈乙?。

2.2 動物分組及模型制備 大鼠適應性喂養1周，完全隨機法選取10只取其顱骨作為植骨的供體，隨機選取30只分為對照組、模型組、健骨顆粒組各10只。大鼠脫頸椎處死，沿顱正中線剪開皮膚，分離顱骨，將顱骨修成4 mm×3 mm大小，完整保留顱骨表面骨膜，置于無菌生理鹽水中備用。

參照文獻［6］制備植骨氣囊骨溶解模型，以大鼠背部正中線距尾根部10 cm為中心，電動剃毛刀剃毛，背部備皮消毒，每天皮下注射無菌空氣，每次1 mL，連續5天，形成氣囊，建立氣囊模型；大鼠禁食不禁水，稱重，10%水合氯醛按0.3 mL／100 g劑量腹腔注射麻醉，碘伏消毒，鋪無菌單，沿氣囊邊緣作切口，將顱骨片植入氣囊中心，每只大鼠植入1片顱骨片，縫合切口，建立氣囊植骨模型。對照組大鼠氣囊內注射0.5 mL生理鹽水，模型組、健骨顆粒組氣囊內注射0.5 mL鈦顆粒懸液，建立骨溶解病理模型。

2.3 藥物干預 術后24 h進行藥物干預，大鼠灌胃劑量按實驗動物體表面積換算，健骨顆粒組按2 g／（kg·d）予健骨顆粒混懸液灌胃，對照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，連續灌胃2周。實驗大鼠均在相同條件下自由攝食、飲水。灌胃結束后取材，取出完整氣囊，將樣本一切為二，一份置于4%多聚甲醛中固定備用；一份過液氮置于－80℃超低溫冰箱保存備用。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 HE染色 將樣本置于4%多聚甲醛中室溫下固定24 h后，10%乙二胺四乙酸二鈉脫鈣4周；水洗，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，石蠟包埋；以顱骨矢狀面為切面，6 μm厚度連續切片，切片脫蠟至水，Ehrlich蘇木素染色40 min，水洗返藍，伊紅染色1 min，脫水透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察囊壁炎癥反應及植骨邊緣溶解情況。200倍鏡下隨機選取4個視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算陽性細胞數量，取均值作為細胞密度。2.4.2 IL-1β、TNF-α含量檢測 取出液氮中樣本，研磨成粉，加入PBS混勻，3000 r／min離心10 min，取上清液，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作，酶標儀測定吸光度，繪制標準曲線，計算樣本IL-1β、TNF-α含量。

2.4.3 OPG、RANKL mRNA表達檢測 采用Realtime PCR法檢測，預冷研體，-80℃中取出樣本，加液氮研磨為粉狀，采用TRIzol提取總RNA，超微量分光光度計測A260／A280比值，按逆轉錄試劑盒逆轉錄合成cDNA，-20℃保存備用。采用ABI 7500 Fast進行熒光實時定量PCR，引物由Takara公司合成，β-actin：上游 5′AGGCTGTGTTGTCCCTGTA 3′，下游 5′ATGTCACGCACGATTTCC 3′，產物長度 193 bp；OPG：上游 5′CGAAAGCACCCTGTAGGAA 3′，下游5′TGTCCACCAGAACACTCAGC 3′，產物長度 145 bp；RANKL：上游5′TGGAGAGCGAAGACACAGA3′，下游 5′CAGACTGACTTTATGGGAACC 3′，產物長度250 bp。 反應體系：（2×）SYBR Premix Ex Taq 10 μL，（50×）ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，（10 μM）PCR Forward Primer 0.4 μL， （10 μM）PCR Reverse Primer 0.4 μL，cDNA 模板 2 μL，滅菌水 6.8 μL。 反應條件：95 ℃，30 s預變性；95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40個循環。β-actin為內參基因，測定目標基因Ct值，以對照組相對表達量為1，2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

2.5 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（x±s）表示，采用單因素方差分析；非正態分布采用非參數檢驗。

3 結 果

3.1 HE染色 HE染色顯示對照組（圖1A）植入顱骨片較完整，骨片表面未見明顯骨吸收，囊壁組織與骨片貼合欠佳，囊壁組織炎性反應輕，以成纖維細胞為主，可見少量的炎癥細胞；模型組（圖1B）骨片表面可見明顯骨吸收，植骨溶解凹陷，囊壁組織與骨片貼合較緊，囊壁增厚，可見明顯炎癥細胞浸潤；健骨顆粒組（圖1C）骨片表面可見骨吸收陷窩，植骨溶解程度、囊壁厚度、炎癥細胞浸潤較模型組低。

3.2 3組干預后IL-1β、TNF-α含量比較 見表1。

3.3 3組干預后 OPG、RANKL mRNA表達比較見表2。

4 討 論

人工關節置換術后假體磨損顆粒誘發炎性反應，單核巨噬細胞增多。單核巨噬細胞可作為破骨細胞前體分化為破骨細胞，炎癥細胞浸潤釋放多種炎癥因子， 如 IL-1β、IL-6、TNF-α、M-CSF、PGE2等［7-8］，是強大的骨吸收誘導劑，可增加破骨細胞的活性。破骨細胞是體內唯一具有骨吸收、骨溶解作用的細胞，其數量的增加和活性的增強引起假體周圍骨溶解，使假體與骨之間空隙增大，造成假體松動。

圖1 植骨囊壁的HE染色圖（×50）

表2 3 組干預后 IL-1β、TNF-α 含量比較（x±s）pg／mL

表3 3組干預后OPG、RANKL mRNA表達比較（x±s）

健骨顆粒以“腎主骨，生髓”“補先后天”理論為指導，選取煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、黨參、淮山藥等組方而成，旨在補腎健脾、強筋壯骨。藥理研究表明：煅狗骨可促進骨基質、新骨形成［9］；淫羊藿苷可抑制RAW264.7向破骨細胞分化及骨吸收活性［10］，淫羊藿苷、淫羊藿黃酮類促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞增殖分化［11-12］；山茱萸總苷可增加骨小梁活性成骨細胞表達，促進骨髓基質干細胞增殖，提高去勢大鼠骨小梁面積［13-14］；黨參炔苷可促進雌性大鼠卵巢顆粒細胞增殖分泌雌二醇［15］。OPG／RANKL／RANK系統是參與骨溶解的核心信號通路，假體旁界膜中存在一個完整的OPG／RANKL／RANK系統，磨損顆粒促使OPG／RANKL比值失衡，從而使假體周圍骨動態失衡，骨吸收活性增強。

本研究中，通過鈦顆粒誘導大鼠建立骨溶解模型，采用載體實驗探討健骨顆粒對鈦顆粒誘導的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系統相關因子的影響，研究結果顯示：鈦顆?？纱碳ぶ补菤饽抑車M織的炎癥細胞浸潤、新生血管增生和滲出，炎性反應明顯，引起破骨細胞分化成熟，植入顱骨片邊緣骨溶解顯著，與臨床人工關節無菌性松動相似，是關節置換術中晚期失敗的主要原因。健骨顆?？山档脱逖装Y因子表達水平，減少植骨氣囊的炎癥細胞浸潤，一定程度上減輕炎性反應程度，并調控OPG／RANKL比值，抑制破骨細胞活性，減少顱骨片邊緣骨吸收陷窩，提示健骨顆粒對于假體周圍骨溶解有潛在防治作用。

綜上所述，健骨顆粒可有效降低炎癥反應程度，調控OPG／RANKL比值，抑制破骨細胞活性，可能是其防治人工假體松動的作用機制之一，為其臨床用藥提供實驗基礎。

［1］ INACIO M C，AKE C F，PAXTON E W，et al.Sex and risk of hip implant failure：assessing total hip arthroplasty outcomes in the United States ［J］.JAMA Intern Med，2013，173（6）：435-441.

［2］ GOODMAN S B，GIBON E，PAJARINEN J，et al.Novel biological strategies for treatment of wear particle-induced periprosthetic osteolysis of orthopaedic implants for joint replacement ［J］.J R Soc Interface，2014，11（93）：20130962.

［3］ 元宇，郭健民，鄒軍.OPG／RANKL／RANK信號通路在運動與骨免疫學中的研究進展［J］.中國骨質疏松雜志，2015，21（8）：1005-1010.

［4］ 林海鳴，林燕萍，吳銀生.健骨顆粒含藥血清對成骨樣細胞OPG、RANKL mRNA表達的影響［J］.福建中醫藥大學學報，2012，22（1）：19-21.

［5］ 丁懷利，吳銀生，林煜，等.大鼠成骨細胞RANKL-OPG mRNA表達的增齡性變化及淫羊藿甙的干預作用［J］.中醫正骨，2010，22（4）：7-10.

［6］ 陳德勝，李燕，郭鳳英，等.鈦顆粒誘導小鼠植骨氣囊骨溶解模型的構建［J］.寧夏醫科大學學報，2016，38（11）：1228-1231.

［7］ 夏琳.TNF-α對RANKL體外誘導破骨細胞分化的促進作用及其機制探討［D］.濟南：山東大學，2013.

［8］ 邱奕雁，朱峰，藍濤，等.IL-6，IL-1β及 TNF-α與大鼠骨質疏松形成的關系［J］. 現代生物醫學進展，2016，16（18）：3448-3451.

［9］ 林燕萍，王和鳴，陳奕權，等.煅狗骨對實驗性骨折愈合作用的組織學和組織化學研究［J］.中國中醫骨傷科雜志，1991，7（6）：4-9.

［10］李偉娟，謝保平，石麗穎，等.從ERα／RANK通路探討淫羊藿苷抑制破骨細胞分化作用［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（7）：121-126.

［11］曾建春，曾意榮，樊粵光，等.淫羊藿甙誘導MSCs向成骨細胞分化過程中對Wnt信號通路的影響［J］.廣州中醫藥大學學報，2014，31（4）：607-611，678.

［12］許靜，張晶晶，郭非非，等.淫羊藿黃酮類主要成分促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞增殖分化作用及機制的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2017，23（14）：113-120.

［13］王艷，宋春靜，孫秀巖，等.山茱萸總苷及其含藥血清對MSCs增殖的影響［J］.天津中醫藥大學學報，2013，32（2）：101-104.

［14］李晶，武峻艷，王慧明，等.山茱萸總苷對去勢大鼠骨組織形態學影響的實驗研究［J］.上海中醫藥雜志，2010，44（1）：69-72.

［15］唐曉靜，江濤，徐斯凡.黨參炔苷對雌性大鼠卵巢顆粒細胞增殖分化的影響及其作用機制［J］.生殖與避孕，2015，35（9）：587-592，639.