貴州特色苦蕎食品黃酮與免疫調(diào)節(jié)作用評價

李勇，曾海英，2，*

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025；2.貴州省薏苡工程技術研究中心，貴州貴陽550025）

隨著人們生活質量的提高，社會對健康的意識逐漸增強，保健食品越來越受到人們的喜愛，蕎麥作為一種藥食同源的雜糧不僅營養(yǎng)豐富而且具有很強的保健作用，現(xiàn)代研究表明：苦蕎黃酮有降血糖血脂、抗疲勞、抗缺血、抗氧化、增強機體免疫力等多種保健作用[1-3]。盡管苦蕎黃酮保健作用強，但不同產(chǎn)品、不同工藝，苦蕎食品黃酮的保留率及保健功效特性等是否存在較大差異，或蕎麥的添加量與苦蕎食品的保健功效關聯(lián)性等研究均未見報道。因此，本研究著眼于貴州蕎麥，以地方特色蕎食為研究對象，通過對苦蕎茶、苦蕎米、苦蕎面粉、苦蕎掛面以及苦蕎羹5類蕎食進行黃酮組分分析，并對其免疫調(diào)節(jié)作用進行綜合評價，采用模糊數(shù)學綜合評價法得出5類蕎食的免疫調(diào)節(jié)作用差異性，探討黃酮含量與免疫調(diào)節(jié)作用的關聯(lián)性，為貴州特色苦蕎食品的研發(fā)與推廣提供前期研究數(shù)據(jù)及技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎米、苦蕎茶、苦蕎面粉、苦蕎掛面、苦蕎羹：貴州省內(nèi)苦蕎生產(chǎn)企業(yè)；KM小鼠，6周～8周齡，雌雄各半，SPF級，體重18 g～22 g：重慶騰鑫生物技術有限公司，實驗動物合格證號為：SCXK（軍）2012-0011；免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）測定試劑盒：上海鼓臣生物技術有限公司；2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）：成都西亞試劑有限公司；環(huán)磷酰胺：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；瑞氏染料：天津市光復精細化工研究所；雞紅細胞、補體（豚鼠血清）：貴州大學釀酒與食品工程學院貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室自制。

1.2 儀器與設備

1220型液相色譜儀：美國安捷倫公司；TU-1810紫外分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；TGL20M臺式高速冷凍離心機：長沙邁佳森儀器設備有限公司；光吸收酶標儀SpectraMax 190：美谷分子儀器（上海）有限公司；MoticAE31倒置相差顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品黃酮類成分測定

樣品處理：取經(jīng)粉碎樣品1 g，用60%的乙醇，料液比1∶25（g/mL），50℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加5 mL 60%乙醇清洗然后離心合并上清液重復3次，于50 mL容量瓶中定容，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液備用。

色譜條件：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0.4%磷酸溶液（1∶1，體積比），流速：1.0 mL/min，柱溫：35.0℃，檢測波長：360 nm，進樣量：20 μL。

標準曲線：精密稱取蘆丁對照品20.00 mg，槲皮素對照品4.00mg，山奈酚-3-O-蕓香糖苷對照品4.00 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，取 0.5、1.0、1.5、2.0 mL 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得蘆丁對照品溶液濃度分別為 0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL，山奈酚-3-O-蕓香糖苷和槲皮素對照品溶液濃度分別為0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL。通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定，繪制標準曲線。

1.3.2 樣品乙醇提取物制備

取經(jīng)粉碎樣品100 g，60%乙醇，料液比1∶25（g/mL），50℃超聲浸提30 min（超聲功率600 W，頻率40 kHz），離心取上清液，加200 mL 60%乙醇搖勻然后離心合并上清液，真空濃縮至5 g，即1 g醇提樣品相當于20 g原樣。

1.3.3 構建小鼠免疫低下模型

參照肖雪筠[4]等方法稍作修改，KM小鼠，隨機分為空白對照組、環(huán)磷酰胺對照組、其中苦蕎茶組（tartary buckwheat tea group，TBT）、苦蕎米組（tartary buckwheat rice group，TBR）、苦蕎面粉組（tartary buckwheat flour group，TBF）、苦蕎掛面組（tartary buckwheat noodles group，TBN）、苦蕎羹組 （tartary buckwheat paste group，TBP），各設置高、中、低 3個灌胃劑量組，灌胃劑量分別為 600、300、150 mg/kg·bw，每組 10 只。各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，注射量為60 mg/kg·bw，空白對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續(xù)3 d，構建環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。小鼠免疫功能低下模型建立后，實驗各組按照各自劑量灌胃，空白對照組及環(huán)磷酰胺對照組灌胃等劑量的生理鹽水。

1.3.4 脾臟和胸腺指數(shù)的測定

小鼠連續(xù)灌胃9天后，禁食不禁水，24小時后，頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺，稱重記數(shù)，計算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)＝脾臟重量（mg）/體重（g），胸腺指數(shù)＝胸腺重量（mg）/體重（g）。

1.3.5 血清中IgG、IgM含量的測定

小鼠連續(xù)灌胃10天后，摘眼球取血，1500 r/min離心10 min，取血清，然后按照IgG、IgM測定試劑盒的使用說明書進行。

1.3.6 血清溶血素水平的測定

小鼠連續(xù)灌胃6天后，各鼠腹腔注射2%的雞紅細胞混懸液0.2 mL，4天后，摘眼球取血，1500 r/min離心10 min，取血清，用生理鹽水稀釋至100倍，取1 mL，加10%的雞紅細胞懸浮液0.5 mL、10%的補體1 mL，混合均勻于37℃水浴30 min，置0℃冰箱中中止反應。1500 r/min離心5 min，取上清液于450 nm處測吸光度值。與不加血清的生理鹽水試管作對照。頸椎脫臼處死小鼠。

1.3.7 耳腫脹率的測定

小鼠連續(xù)灌胃6天后，于腹部涂抹8%的硫化鈉去毛，均勻涂抹 5%DNFB 50 μL，3天后，于小鼠左耳均勻涂抹1%DNFB 20 μL，于右耳均勻涂抹20 μL丙酮溶液進行對照，24小時后，頸椎脫臼處死，用打孔器取直徑8 mm的耳片，稱重，計算腫脹率，腫脹率/%=（左耳/右耳-1）×100。

1.3.8 單核-巨噬細胞功能的測定

小鼠連續(xù)灌胃6天后，每只小鼠腹腔注射4%的淀粉肉湯1 mL，以引誘體內(nèi)的巨噬細胞向腹腔聚集；間隔2小時后，每只小白鼠注射1%的雞紅細胞懸液1 mL。再間隔2 h，頸椎脫臼處死，室溫保持在27℃避免尸體僵硬，剪開腹壁皮膚，腹腔注射生理鹽水 2 mL，用手輕柔5 min，吸取腹液1 mL均勻涂于載玻片上，立即37℃孵育30 min，用生理鹽水緩慢沖洗1 min，吹干，染色進行觀察。

計數(shù)：油鏡下觀察，以巨噬細胞數(shù)200個為記數(shù)范圍，同時記數(shù)其中吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)，記錄結果，計算吞噬率，吞噬率/%=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞/200×100。

2 結果與分析

2.1 樣品黃酮類成分測定

樣品、混合對照品色譜圖見圖1，樣品黃酮類成分測定見圖2。

圖1 樣品、混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of samples and mixed reference substances

圖2 樣品黃酮類成分測定Fig.2 Determination of samples flavonoids

由圖2可以看出，不同苦蕎食品中總黃酮由蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、槲皮素組成，蘆丁為主要成分，且含量呈顯著性差異（P＜0.05）。苦蕎茶的總黃酮、蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，分別為19.83、19.04、0.67 mg/g；苦蕎羹的槲皮素含量最高，達0.87 mg/g。

2.2 乙醇提取物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響

脾屬于外周免疫器官，是動物體內(nèi)最大的免疫器官。胸腺屬于中樞淋巴器官，是T細胞分化成熟的主要場所，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的大小可反映機體免疫功能的強弱[5-6]，各蕎食醇提物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響見表1。

表1 乙醇提取物對小鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響（M±SD，n=10）Table 1 Effects of ethanol extract on mouse spleen and thymus index（M±SD，n=10）mg/g

由表1可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組脾臟和胸腺指數(shù)較模型對照組均有所增加，且呈現(xiàn)劑量效應。TBT、TBR高劑量組胸腺指數(shù)增加顯著（P＜0.05），其中TBT高劑量組胸腺指數(shù)最高，達4.99 mg/g；TBT、TBR高劑量組脾臟指數(shù)增加極顯著（P＜0.01），其中TBT高劑量組脾臟指數(shù)最高，達7.78 mg/g。表明各蕎食醇提物能修復小鼠脾臟和胸腺或促進其發(fā)育，其中TBT效果最明顯。

2.3 乙醇提取物對小鼠IgG、IgM含量的影響

免疫球蛋白是免疫活性分子中的一類，按結構分為5類，分別稱免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白 M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白D（immunoglobulin D，IgD）和免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE），其中 IgG、IgM 的含量高、分布廣，是全身性體液免疫反應的主要效應分子，IgG、IgM的含量高低可反映出機體體液免疫能力的強弱[7]，各樣品醇提物對小鼠IgG、IgM含量的影響見表2。

表2 乙醇提取物對小鼠IgG、IgM含量的影響（M±SD，n=10）Table 2Effects of ethanol extract on mouse IGG、IGM conten（tM±SD，n=10） mg/100 mL

由表2可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組IgG、IgM含量較模型對照組均有所增加，且呈現(xiàn)劑量效應。TBT、TBR、TBF、TBP高劑量組、TBT、TBR中劑量組IgG含量增加極顯著（P＜0.01），TBF 中劑量組增加顯著（P＜0.05），其中TBT高劑量組IgG含量最高，達1092.71 mg/100 mL；TBT、TBR、TBF高劑量組IgM含量增加極顯著（P＜0.01），TBP 高劑量組、TBT、TBR、TBF 中劑量組增加顯著（P＜0.05），其中TBT組IgM含量最高，達 168.75 mg/100 mL。表明各蕎食醇提物均可提高血清中IgG、IgM含量，其中以TBT組的效果最為明顯。

2.4 乙醇提取物對小鼠血清溶血素水平的影響

溶血素是指任何能使紅細胞溶解并釋放出血紅蛋白的物質，屬于特異性體液免疫，血清中溶血素含量能反映出機體體液免疫能力的強弱[8-9]，各樣品醇提物對小鼠血清溶血素水平的影響見表3。

由表3可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組血清溶血素水平較模型對照組均有所提高，且呈現(xiàn)劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組、TBT中劑量組提高極顯著（P＜0.01），TBP 高劑量組、TBR、TBF 中劑量組顯著 （P＜0.05），其中TBT組血清溶血素OD450值最高，達0.49。表明各蕎食醇提物均可提高血清溶血素水平，其中TBT組的效果最為明顯。

表3 對免疫低下小鼠血清溶血素水平的影響（M±SD，n=10）Table 3 Effects of ethanol extract on mouse serum hemolysin levels（M±SD，n=10）

2.5 乙醇提取物對小鼠耳腫脹率的影響

遲發(fā)型過敏反應屬于細胞免疫，當抗原進入機體后，機體產(chǎn)生致敏淋巴細胞，當再次受到同一抗原刺激后，單核-巨噬細胞向局部聚集和吞噬抗原而引起皮膚局部腫脹的一種反應，其腫脹厚度可反映細胞免疫功能的強弱[10-11]，各樣品醇提物對小鼠耳腫脹率的影響見表4。

由表4可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組耳腫脹率較模型對照組均有所增加，且呈現(xiàn)劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組增加極顯著（P＜0.01），TBP高劑量組TBT、TBR、TBF中劑量組增加顯著（P＜0.05）。其中TBT組耳腫脹率最高，達122.09%。表明各蕎食醇提物均可提高耳腫脹率，其中以TBT組的效果最為明顯。

表4 乙醇提取物對小鼠耳腫脹率的影響（M±SD，n=10）Table 4 Effects of ethanol extract on mouse ear swelling rate（M±SD，n=10）

2.6 乙醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響

單核-巨噬細胞能對外來異物進行識別和清除，具有強大的吞噬殺傷作用，吞噬率可以反映機體非特異性免疫功能的強弱[12-13]，各樣品醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響見表5。

表5 乙醇提取物對小鼠單核-巨噬細胞吞噬率的影響（M±SD，n=10）Table 5 Effects of ethanol extract on mouse mononuclearmacrophage phagocytic rate（M±SD，n=10）

由表5可知，小鼠免疫低下模型成立（空白對照組與模型對照組比較P＜0.01）。各劑量組吞噬率較模型對照組均有所增加，且呈現(xiàn)劑量效應。TBT、TBR、TBF高劑量組增加極顯著（P＜0.01），其中TBT組耳腫脹率最高，達49.20%。表明各蕎食醇提物均可提高吞噬細胞吞噬率，其中以TBT組的效果最為明顯。

2.7 模糊數(shù)學綜合評價

由于免疫學評價方法涉及多個指標，很難用單一的標準評價5種苦蕎食品的免疫調(diào)節(jié)作用的強弱，模糊分析法可以按照單因素中各指標間的隸屬度關系，各因素的對實驗結果的貢獻率，建立模糊評價的函數(shù)，對多個因素結果進行處理，得到最終模糊總評，所以采用模糊數(shù)學綜合評價5種苦蕎食品免疫調(diào)節(jié)作用的強弱。

2.7.1 因素集及權重集

由2.2～2.6分析結果可知，各蕎食醇提物與免疫調(diào)節(jié)作用存在劑量效應，且以高劑量組免疫調(diào)節(jié)作用最強，在此以各蕎食醇提物高劑量組免疫學評價指標為因素集，即U={腺指數(shù)，脾臟指數(shù)，IgG含量，IgM含量，血清血溶素水平，耳腫脹率，吞噬率}；綜合考慮腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、IgG含量、IgM含量、血清學溶素水平、耳腫脹率、吞噬率7個指標的重要性程度分配權重集為α={0.1，0.1，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2}。

2.7.2 單因素隸屬度函數(shù)及隸屬度矩陣

本研究用環(huán)磷酰胺構建小鼠免疫低下模型，按免疫學評價方法判定5種苦蕎食品免疫調(diào)節(jié)作用，各項指標大小均介于模型組與空白組之間，則實驗組各指標相對于空白組與模型組的大小可以代表其免疫調(diào)節(jié)作用的強弱，所以屬度函數(shù)采用升半梯型函數(shù)模型，見圖3，式（1）。

圖3 升半梯型函數(shù)模型Fig.3 Ascending ladder type function model

式中：rij為第i個因素指標第j個樣品的隸屬度，且0≤rij≤1；b為第i個因素指標的最大值，即空白對照組；a為第i個因素指標的最小值，即模型對照組。

根據(jù)式（1）得出隸屬度矩陣（R），式（2）。

根據(jù)（2）結合2.2～2.6實驗數(shù)據(jù)，計算結果見評價矩陣（3）

選取評價函數(shù)（4），α 為權重集 α={0.1，0.1，0.1，0.1，0.2，0.2，0.2}，得出總評價 S，見表6。

表6 模糊數(shù)學綜合評價結果Table 6 Comprehensive evaluation result of fuzzy mathematics

根據(jù)表6可知，TBT、TBR、TBF、TBN、TBP 組模糊總評結果均為正數(shù)，說明各蕎食醇提物均能提高免疫低下小鼠的免疫活性，其中TBT組評分最高，達71.13分。表明各蕎食醇提物均有免疫正向調(diào)節(jié)作用，其能力依次為苦蕎茶＞苦蕎米＞苦蕎面粉＞苦蕎羹＞苦蕎掛面。

2.8 樣品黃酮總量與免疫調(diào)節(jié)作用關聯(lián)性分析

黃酮總量與模糊總評間的關系見圖4。

圖4 黃酮總量與模糊總評間的關系Fig.4 Relationship between total flavonoids and fuzzy total evaluation

根據(jù)圖4可知，蕎食總黃酮含量與免疫調(diào)節(jié)模糊總評間呈極顯著（r=0.989，P＜0.01）的關聯(lián)性。表明各蕎食醇提物能增強免疫低下小鼠的免疫能力，且與其黃酮含量呈正相關。前人大量研究也均表明，苦蕎黃酮可增強機體的非特異性免疫、細胞免疫和體液免疫功能，提高機體的免疫能力[4，14-15]。

3 結論

由實驗結果可知，貴州5種苦蕎食品醇提物各劑量組均可提高免疫低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)、血清中IgG、IgM含量、血清血溶素水平、耳腫脹率及單核-巨噬細胞吞噬率，說明貴州5種苦蕎食品具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。5種苦蕎食品免疫調(diào)節(jié)功效不一，且具劑量效應，并與其黃酮含量呈極顯著的關聯(lián)性（P＜0.01）。說明苦蕎食品醇提物的免疫調(diào)節(jié)作用與黃酮含量呈正相關，但苦蕎食品醇提物究竟是哪種成分在調(diào)節(jié)免疫功能方面發(fā)揮著作用，還需實驗去進一步探討與驗證。

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