水產品中的形態汞測定方法的比較與分析

喬晴，彭新然，劉軍紅，何兵兵，李辰

（河南出入境檢驗檢疫局，河南鄭州450003）

汞是具有揮發性、持久富集性、毒性較大的有毒重金屬元素之一。汞的不同形態表現出的毒性不同，都會損害人體的神經系統、免疫系統，嚴重威脅人類健康，其中有機汞中的甲基汞毒性最大。汞及其化合物廣泛存在于環境和食物鏈中，尤其是魚、貝類等人類經常攝入的水產品，通過食物鏈生物放大作用，體內富集的汞含量遠超出環境中汞含量，并且主要以甲基汞形態存在[1-4]。因此，對水產及制品中的甲基汞檢測尤為重要。

近年來，形態分析方法的建立和改進，已經成為分析研究的一大趨勢。針對生物樣品分析的前處理方法有多種，而微波消解法、超聲提取法具有提取效率高、操作簡便、適應性廣等優勢[5-6]。汞的形態分析主要有采用氣相色譜－質譜聯用法，原子熒光、紫外檢測器、電感耦合等離子體質譜的檢測手段與高效液相色譜的分離手段聯用等各種技術[7-10]。這些分析方法極大的方便了測定水產及制品中甲基汞和無機汞含量。

本文采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對樣品前處理，優化處理的條件，比較實驗條件對提取效果的影響。然后采用液相色譜-電感耦合等離子體質譜聯用法（high performance liquid chromatographyinductive coupled plasma emission spectrometer-mass spectrometer，HPLC-ICP-MS）和液相色譜-原子熒光聯用法（liquid chromatography-atomic fluorescence spectroscopy，LC-AFS），選擇最佳儀器條件測定水產及制品中的甲基汞和無機汞含量。本文通過研究有害元素汞的形態分析技術實現對水產及其制品中的甲基汞、無機汞含量的準確檢測，將為保障我國食品安全，預防汞污染對人體的危害，應對國外技術壁壘，提高本國產品的出口競爭力提供參考依據，具有很強的應用前景和潛在的社會效益。

1 材料與方法

1.1 儀器

MARS 5微波消解儀：CEM公司；LC-AFS 6500液相色譜原子熒光聯用儀：北京科創海光公司；ICP-MS 7900電感耦合等離子體質譜儀、HPLC 1200高效液相色譜、ICP-MS PFA霧化器、Zorbax Eclipse Plus C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：美國安捷倫公司；Agela Venusil MP C-18（150 mm×4.6 mm，5 μm）：博納艾杰爾科技有限公司；XP205型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Z300K高速冷凍離心機：德國哈默公司；KANG SHIJIE PL-J60超聲波清洗機：東莞康士潔公司；0.45 μm濾膜：天津市津騰實驗設備有限公司；Millipore超純水系統：法國密理博公司。

1.2 試劑

試驗用水為符合GB/T 6682-2008《分析實驗室用水規格和試驗方法》規定的一級水；氫氧化鉀（優級純）、硼氫化鉀（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；過硫酸鉀（分析純）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（生化試劑）：天津市致遠化學試劑有限公司；氨水（分析純）：煙臺市雙雙化工有限公司；乙酸銨（優級純）、甲醇（色譜純）：賽默飛世爾科技有限公司；氫氧化鈉（優級純）：國藥化學試劑有限公司；鹽酸（優級純）：北京化工廠；甲基汞標準溶液（GBW 08675，63.6±2.4 μg/g）、無機汞標準溶液（GBW 08617，1000 μg/mL）：國家標準物質研究中心。

1.3 溶液的配制

5 mol/L鹽酸：量取41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸：稱取0.1 g L-半胱氨酸，用水溶解，緩慢加入41.66 mL鹽酸，用水稀釋定容至100 mL。

氫氧化鈉溶液（6 mol/L）：稱取24 g氫氧化鈉溶于水并稀釋至100 mL。

LC-AFS流動相（5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸）：稱取0.5 g L-半胱氨酸，2.2 g乙酸銨，至于從500 mL容量瓶中，用水溶解，加入25 mL甲醇，定容500 mL。用20%氨水溶液調節pH值至7.5，經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣30 min。

HPLC-ICP-MS流動相A（10 mmol/L乙酸銨，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：稱取0.771 g乙酸銨和1 g L-半胱氨酸，用水溶解，加水稀釋定容至1000 mL。用20%氨水溶液調節pH值至7.5，經0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣30 min；流動相B：甲醇。

甲基汞標準儲備液（2 μg/mL）：準確稱取0.7862 g甲基汞標準溶液，用2%甲醇稀釋定容至25 mL。

無機汞標準儲備液（2 μg/mL）：準確稱取10 mL無機汞標準溶液，用5%鹽酸稀釋定容至100 mL，再分取2 mL用2%甲醇稀釋定容至100 mL。

混合標準使用液（50 ng/mL）：準確移取甲基汞標準儲備液和無機汞標準儲備液各0.625 mL，用2%甲醇稀釋定容至25 mL，使用時現配。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

取三文魚可食部分，用搗碎機打成勻漿，混勻，均分成兩份作為試樣，分別裝入潔凈的容器內，密封并標明標記。試樣應于-18℃以下保存。

1.4.2 微波消解前處理法

稱取樣品1 g（精確到0.001 g），加入10 mL5 mol/L鹽酸，按照預先設定的條件消解，微波消解儀參數見表1。

表1 微波消解儀參數Table 1 Parameters of microwave digestion instrument

取1 mL樣液至25 mL刻度管中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）溶液，調節pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm濾膜過濾，待測。同時作空白試驗。

1.4.3 超聲輔助提取前處理法

稱取樣品1 g（精確到0.001 g），置于25 mL離心管中，加入10 mL提取溶液（5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸），放置過夜。在20℃下超聲萃取1.5 h，期間振搖數次。于4℃下以4500 r/min離心30 min。移取4 mL上清液至25 mL刻度管中，緩慢逐滴加入氫氧化鈉溶液（6 mol/L）溶液，調節pH值至2～7，用水定容至10 mL，用0.45 μm濾膜過濾，待測。同時作空白試驗。

1.4.4 LC-AFS法儀器條件

色譜柱：AgelaVenusilMPC-18分析柱，長150mm，內徑4.6 mm，粒度5 μm；流動相：5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨 +0.1%L-半胱氨酸；進樣體積：100 μL；流速：1.4 mL/min。

載流：10%HCl；氧化劑：過硫酸鉀溶液（2 g/L）；還原劑：硼氫化鉀溶液（2 g/L）；紫外消解儀：開；負高壓：300 V；原子化器高度：10 mm；燈電流：30 mA；載氣流量：500 mL/min；屏蔽氣流量：900 mL/min；泵轉速：80 r/min。

1.4.5 HPLC-ICP-MS法儀器條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相：流動相 A ∶流動相B=98 ∶2；流速：1.0 mL/min；進樣量：50 μL。

射頻功率：1550 W；射頻匹配：1.80 V；載氣流量：0.44 L/min；采樣深度：8.0 mm；霧化室溫度：-5℃；積分時間：1 s；質量數：202；蠕動泵轉速：0.30 r/s。

1.4.6 樣品測定

分別采用1.4.4和1.4.5所述儀器條件依次對混合標準溶液系列、空白溶液和試樣溶液進行測定，以其標準溶液峰的保留時間定性，用標準工作曲線對試樣進行定量。按步驟，對同一試樣進行平行試驗測定。

2 結果與討論

2.1 兩種樣品前處理方法的比較

樣品的前處理方法是汞的形態分析中最重要的步驟之一，關鍵是如何防止樣品污染，克服汞的吸附和揮發，避免汞及其化合物在提取過程中可能產生的損失[11-12]。

2.1.1 提取劑的選擇

水產及制品的樣品基體復雜，蛋白含量高，試驗比較了堿消解和酸消解的提取效果，發現酸消解的提取效果和穩定性更好，而堿消解提取所需時間較長，在甲基汞含量較低時會存在復雜的基體效應。因此，試驗選用5 mol/L鹽酸作為水產及其制品樣品汞形態分析的提取劑。

2.1.2 微波消解前處理法條件優化

微波消解萃取試劑污染小，重現性高，在微波消解過程中不會破壞碳-金屬元素鍵，適用于元素形態分析的前處理[13-15]。微波消解的溫度和消解時間對樣品中汞及化合物的提取效率均有影響。若微波消解溫度太低反應速度慢，消解時間太長。若微波消解溫度壓力過高，反應劇烈，極易造成汞及化合物的損失。試驗選取標準物質SRM 2976貽貝（甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg）進行測定，加入 25 μg/kg的無機汞、甲基汞混合標準溶液，分別選擇5個保持時間和5個消解溫度，通過HPLC-ICP-MS測定樣品的加標回收率進行微波消解條件優化，結果見表2。

表2 微波輔助提取的加標回收率Table 2 Recoveries of microwave-assisted extraction

結果表明，微波消解優化最佳條件為消解溫度為85℃，提取劑為5 mol/L鹽酸，保持時間為15 min。另外，要選擇高壓密閉的微波消解儀進行消解提取，防止汞及化合物的損失。

2.1.3 最佳超聲提取條件的確定

目前汞的形態分析主要是通過鹽酸+L-半胱氨酸作為提取溶液[16]，L-半胱氨酸中的S與Hg結合形成金屬-半胱氨酸絡合物，并在一定的酸度下，把樣品中無機汞和甲基汞提取出來。試驗選取標準物質SRM 2976貽貝進行測定，加入25 μg/kg的無機汞、甲基汞混合標準溶液，HPLC-ICP-MS測定不同鹽酸、L-半胱氨酸用量以及不同超聲時間的加標回收率，結果見表3。

表3 超聲輔助提取的加標回收率Table 3 Recoveries of ultrasonic-assisted extraction

結果表明，鹽酸濃度越大加標回收率越高，但鹽酸濃度逐漸增加，中和鹽酸的堿溶液增多，會對ICP-MS檢測器有影響，綜合考慮，選取5 mol/L鹽酸+0.10%L-半胱氨酸，超聲提取1.5h作為最佳超聲提取條件。

2.2 兩種測定分析方法的比較

2.2.1 LC-AFS法操作要點

依據GB 5009.17-2014《食品安全國家標食品中總汞及有機汞的測定》中第二篇食品中甲基汞的測定，選擇流動相為5.0%甲醇+0.06 mol/L乙酸銨+0.10%L-半胱氨酸，測定5 ng/mL汞混合標準溶液，無機汞、甲基汞的保留時間分別為1.810 min，2.592 min，結果見圖1。

圖1 LC-AFS色譜分離圖Fig.1 The separation chromatographic of LC-AFS

2.2.2 HPLC-ICP-MS法操作要點

試驗選用乙酸銨為緩沖鹽來調節峰形，L-半胱氨酸作為絡合劑與各種汞形態反應形成非極性化合物進行分離，改變流動相中甲醇的含量使出峰時間最佳。通過比較，選擇流動相A（10 mmol/L乙酸銨，0.10%L-半胱氨酸，pH=7.5）：流動相 B（甲醇）=（體積比為 98∶2），測定5 ng/mL汞混合標準溶液，無機汞、甲基汞的保留時間分別為1.751 min，2.501 min，見圖2。

圖2 HPLC-ICP-MS色譜分離圖Fig.2 The separation chromatographic of HPLC-ICP-MS

2.3 標準曲線和檢出限

混合標準工作液：分別移取混合標準使用液0、0.2、0.4、0.8、1.2、2.0 mL 于一組 10 mL 容量瓶中，用流動相定容至刻度，得到甲基汞和無機汞的濃度分別0.0、1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 ng/mL 的混合標準工作液。

待儀器狀態穩定后，調節LC-AFS和HPLC-ICPMS儀器條件達到最優，以色譜峰面積為縱坐標，標準溶液中無機汞和甲基汞的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程和相關系數，檢出限為3倍基線噪聲（3S/N），結果見表4。

表4 線性范圍和方法檢出限Table 4 Calibration curve and limit of detection

由表4可以看出LC-AFS和HPLC-ICP-MS兩種方法的無機汞、甲基汞在1.0 ng/mL～10 ng/mL范圍內呈現良好的線性關系，檢出限均可滿足檢測要求。

2.4 回收率和精密度

按照1.4.4和1.4.5中所列儀器條件，選取三文魚肉樣品，進行不同濃度水平的加標回收率和精密度實驗。結果見表5。

表5 加標回收率和精密度結果Table 5 Recoveries and precisions

續表5 加標回收率和精密度結果Continue table 5 Recoveries and precisions

結果表明，4種試驗方法測定甲基汞、無機汞加標回收率結果可達到GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》要求，其中超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質譜法的重現性最好。

2.5 標準物質的驗證

采用1.4中4種試驗方法，用標準物質SRM 2976貽貝（甲基汞范圍28.09±0.31 μg/kg）驗證方法準確性，結果見表6。

表6 標準物質測定結果Table 6 Results of standard reference materials

結果表明，4種試驗方法甲基汞結果均在范圍以內，超聲提取-液相色譜-電感耦合等離子體質譜法的重現性最好。

3 結論

試驗采用超聲輔助和微波輔助酸提取兩種方法對樣品進行前處理，然后用LC-AFS和HPLC-ICP-MS測定水產及制品中的無機汞和甲基汞含量。經過比較，兩種前處理方法均有較高的提取率，微波輔助提取節省時間，試劑、污染小；超聲輔助萃取的操作簡單，應用性更強。兩種測定方法的檢出限、回收率和精密度均能滿足水產及制品的檢測要求，LC-AFS結構簡單，易操作，分析成本低，但在LC-ICP-MS價格昂貴，操作要求高，但靈敏度高，選擇性強，對分析基質復雜樣品中的甲基汞和無機汞分離效果更穩定可靠，準確度高。因此，超聲輔助萃取HPLC-ICP-MS法更適合測定水產及制品中的無機汞和甲基汞含量。

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