一株戊糖片球菌對發酵羊肉干品質的影響

張開屏，張保軍，田建軍，*

（1.內蒙古商貿職業學院食品工程系，內蒙古呼和浩特010070；2.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018）

羊肉干是在油炸、微波、高溫等條件下制作而成一種水分含量較低、貨架期較長、具有特殊肉香味的干肉制品，通過微生物發酵可改善肉干質地、色澤及風味，是消費者最為喜愛的一種肉干產品[1-2]。肉干干燥方式包括自然干燥和熱風干燥，自然干燥主要被用于牧戶自制肉干，而熱風干燥主要被用于工業化生產。因熱風干燥過程溫度控制較為自動化，從而降低制作成本，但產品干燥速率表現為內慢外快，致使肉干表面結痂較為嚴重，同時易引起內部酶變，常需添加嫩化劑進行嫩化處理達到改善肉干質地和品質的目的[3-5]。國外學者通過改進羊肉干干燥方式達到改善羊肉干物性特性的目的，Shi等[6]研究表明，利用紅外-熱風組合（combination of Infrared-hot air，CMIHA）干燥方法處理后藍莓質構特性好于經熱風干燥后樣品的品質。為了改善經熱風干燥而造成羊肉干過度硬化，目前國內已采用多種嫩化方法，如滾揉、添加外源蛋白酶、添加CaCl2嫩化劑等[7-8]。添加外源酶嫩化處理主要原理：外源酶在適宜溫度和一定時間內分解肌肉中肌原纖維蛋白及膠原蛋白起到嫩化作用。本試驗主要通過添加外源木瓜蛋白酶及具有較強抗氧化、清除自由基等特性的戊糖片球菌制作發酵羊肉干，以自然發酵為對照，探究木瓜蛋白酶、戊糖片球菌及其復配對羊肉干品質特性的影響，旨在為發酵羊肉干的工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設備

羊后腿肉（去肥膘及筋膜）、食鹽、綿白糖、黑胡椒粉、生姜、洋蔥、生抽：市售；谷氨酸鈉、亞硝酸鹽（均為食品級）：呼和浩特美通市場；戊糖片球菌（內蒙古傳統風干肉中分離）：內蒙古農業大學肉品科學與技術團隊提供；木瓜蛋白酶（80萬U/g）：江蘇寶萊生物科技有限公司。

TA.XT Express質構儀：英國Stable Micro System公司；TCP色差儀：北京奧依克光電儀器公司；SIGMA 3-18K高速臺式冷凍型離心機、BSA223S-CW電子精密天平：德國Sartorius公司；KDY-9830凱氏定氮儀：北京瑞邦興業科技有限公司；PB-10 pH計：德國Sartorius公司；Lab Master-Aw控溫臺式水活度測定儀：瑞士Novasina公司。

1.2 工藝配方

1.2.1 配方

食鹽 5 g/kg；發酵劑 107CFU/g；白砂糖 0.5%；葡萄糖0.1%；黑胡椒粉0.5%；生姜0.5%；洋蔥0.5%；生抽5 mL/kg；亞硝酸鹽70 mg/kg；硝酸鹽100 mg/kg。

1.2.2 工藝

發酵羊肉干工藝條件見表1。

表1 發酵羊肉干工藝條件Table 1 The process conditions of fermented dry mutton

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

本試驗按照發酵肉制品篩選要求，選用一株具有較強產酸能力、抗氧化、清除自由基能力的戊糖片球菌；并且通過木瓜蛋白酶與戊糖片球菌配比試驗，獲得發酵劑與木瓜蛋白酶最佳添加量分別為107CFU/g和2.4×106U/kg。以不加發酵劑為對照組；只加木瓜蛋白酶，為木瓜蛋白酶組；只加戊糖片球菌，為單一組；木瓜蛋白酶與戊糖片球菌為復配組。樣品分別將原料肉及腌制結束（0.5 d）、發酵結束（2 d）、干燥中期（4 d）、成熟（7 d）等工藝點樣品隨機抽取，并測定如下理化品質。

1.3.2 菌株特性測定

1.3.2.1 完整細胞和無細胞提取物的制備

將篩選好的菌株在MRS液體培養基中連續傳代3次后離心（6500 r/min，7 min），用雙蒸水洗滌3次菌體沉淀后，調整菌懸液濃度為109CFU/mL。將菌懸液分為兩組，一組為完整細胞組，另一組采用超聲波冰浴破碎（功率為400 W，處理5 s、間隔5 s，持續10 min）后，經12000 r/min離心15 min，取上清液即為胞內提取物組。

1.3.2.2 清除DPPH自由基能力的測定

參考Van等[9]方法：取待測液和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）無水乙醇溶液（0.2 mmol/L）各1 mL，混勻后避光反應后30 min 離心（6500 r/min，10 min），測定上清液的OD517。

式中：A1為1 mL的DPPH溶液+1mL樣品的OD值；A2為1 mL無水乙醇+1 mL樣品的OD值；A0為1 mL DPPH溶液+1 mL無水乙醇的OD值。

1.3.2.3 清除羥自由基能力的測定

參照Wu等方法[10]的，在滅菌試管中加入水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L）、FeSO4溶液（5 mmol/L）和 H2O2溶液（3 mmol/L）各 1 mL 混勻后加入不同體積（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL）的待測液，以及與待測液相同體積的VC（1 mmol/L），37 ℃水浴 15 min 后離心（6500 r/min，10 min），測定 OD510。

式中：A1為加入待測溶液后的OD值；A0為用蒸餾水代替樣品溶液的OD值。

1.3.2.4 抗脂質過氧化能力測定

首先將PBS（pH值7.4）與等體積蛋黃混合為1∶25（體積比）的蛋黃懸液。分別取1 mL蛋黃懸液、PBS、FeSO4（25 mmol/L）與 0.5 mL 菌懸液混勻，37 ℃振蕩30 min，然后加入1 mL 20%三氯乙酸，靜置10 min后3500 r/min離心10 min，取3 mL上清液與2 mL TBARS（0.8%）混勻，沸水浴中反應 10 min，冷卻后在532 nm波長處測其吸光值[11]。

式中：A1為樣品溶液的OD值；A0為用PBS代替樣品溶液的OD值。

1.3.3 理化品質的測定

參照GB/T9695.5-2008《肉與肉制品pH測定》測定香腸pH值[12]；參照硫代巴比妥酸法（thiobarbital acid，TBA）測定羊肉干中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[13]；使用HD-3A型智能水分活度儀測定Aw。

成品率：從原料肉開始，每一階段結束測定羊肉干的重量，直到發酵羊肉干成熟。計算公式：X=M/M0，式中：M0為指起始羊肉干質量，g；M為指原料、腌制、發酵、干燥、成熟結束等階段羊肉干質量，g。

1.3.4 羊肉干質構的測定

利用質構儀測量的是發酵羊肉干質構（TPA）參數。TPA試驗同樣將成熟后的發酵羊肉干切為1 cm×1 cm×1 cm（長×寬×高）的立方體，探頭選擇為 P35，測前速度為2 mm/s，測中速度為10 mm/s，測后速度為10 mm/s，目標模式為壓縮模式（compression），應變值選擇40%，時間選為5 s，觸發模式為自動，觸發力選擇5.0 g。通過TPA試驗可以獲得的參數有硬度、咀嚼性、彈性、內聚性、回復性。

1.4 數據處理

采用Excel和Spss19.0對數據進行統計處理和顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 發酵劑菌株特性研究

通過測定菌株抑制率、羥自由基及DPPH自由基清除率等指標，探究發酵特性如圖1。

圖1 戊糖片球菌抗氧化能力研究Fig.1 Study on the antioxidant capacity of P.pentosaceus

圖1比較了戊糖片球菌的完整細胞及胞內提取物的脂質過氧化抑制率、清除DPPH自由基及清除羥自由基能力大小。試驗表明戊糖片球菌抗脂肪氧化及清除羥自由基、DPPH自由基的能力均高于胞內提取物；且兩者抗脂肪氧化、DPPH自由基清除率差異極顯著（P＜0.001）；說明將戊糖片球菌完整細胞應用于發酵肉干有助于提高羊肉干品質及抑制脂質過度氧化。

2.2 發酵羊肉干pH值的變化

發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程pH值變化的影響見圖2。

圖2 發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程pH值變化的影響Fig.2 Effects of starter culture and papain on pH value changes of the fermented dry mutton in the production process

由圖2知，原料肉pH值為5.74，酸度接近排酸后新鮮原料肉酸度值。腌制結束，各組pH值雖有小幅降低，但與原料肉pH值相比差異不顯著（P＞0.05）。0.5 d～2 d發酵期間，4組肉干pH值下降速率顯著升高；添加發酵劑可能促進原料肉中碳水化合物快速分解為乳酸等小分子有機酸，促使單一組和復配組羊肉干pH值下降速率顯著高于對照和木瓜蛋白酶組（P＜0.05），而對照組與木瓜蛋白酶組及單一組與復配組的組間pH值差異不顯著（P＞0.05），說明添加戊糖片球菌可顯著快速降低發酵羊肉干pH值。在2 d～4 d干燥期間，溫度和濕度（RH）低至14℃和75%～85%，低溫和低濕條件可能影響產酸酶類活性降低產酸速率，也可能由于蛋白質分解產生氨類等堿性物質中和羊肉干中乳酸等酸性物質，促使肉干pH值在干燥后期呈現上升趨勢[14-15]；干燥結束，復配組和單一組pH值分別上升至5.56、5.58，其它兩組pH值升至5.66。

2.3 發酵羊肉干Aw的變化

水分活度（water activity，Aw）是衡量食品保質期長短的一個重要物理指標，當Aw＞0.9時，大部分腐敗菌及致病菌可正常生長；當Aw低于0.9時，大部分細菌及有害菌生長均受到抑制；Aw＜0.6時，霉菌及耐鹽細菌代謝活性幾乎為零[16-17]。發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程Aw值變化的影響見圖3。

圖3 發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程Aw值變化的影響Fig.3 Effects of starter culture and papain on Aw value changes of the fermented dry mutton in the production process

由圖3可知，羊肉干在制作初期水分活度變化微小，可能由于腌制時添加配料促使腌制時Aw略高于原料肉。在0.5 d～2 d發酵期間，羊肉干所處環境溫度較高，濕度接近95%，環境條件抑制了羊肉干內部水分向外部環境遷移的速率，導致發酵結束羊肉干Aw下降幅度較小。在2 d～4 d干燥過程中，由于pH值降低，接近蛋白質等電點，致使蛋白質對水分吸附能力下降，此時羊肉干Aw相對腌制結束，變化差異較為顯著（P＜0.05），復配組、單一組、木瓜蛋白酶組及對照組Aw 分別為 0.923、0.924、0.933、0.933，對比說明添加戊糖片球菌有助羊肉干水分活度的降低。4 d～7 d干燥階段，溫度和RH分別被降到13℃、65%，由于溫度和濕度急劇降低，環境較為干燥，環境條件致使羊肉干內部水分大幅向外遷移，成熟結束各組Aw顯著低于干燥結束對應組，且復配組降到組中最低為0.801。

2.4 發酵羊肉干硫代巴比妥酸反應產物（the thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的變化

TBARS實為一種脂質過氧化產物，大量積累不利于產品安全性，據研究報道，TBARS指數越高代表脂質被氧化氧化程度越高；含量處于0.6～2.0時[18]，產品仍為正常，若超過2.0說明產品脂質氧化過程，TBARS過度積累，給產品造成極大危害性。發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程TBARS變化的影響見圖4。

圖4 發酵劑與木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程TBARS變化的影響Fig.4 Effects of starter culture and papain on TBARS changes of the fermented dry mutton in the production process

由圖4可知，原料肉TBARS為0.15；腌制結束，所測得4組TBARS均上升，說明在原料肉切割和腌制過程成中存在脂質微量氧化；發酵過程中，TBARS仍呈上升趨勢，但單一組TBARS（0.25）顯著低于其它3組；在干燥過程，木瓜蛋白酶組TBARS值（0.68）最高，而單一組最低（0.46），說明添加木瓜蛋白酶可能會促使脂質過度氧化；干燥第二階段，4組TBARS仍快速上升，通過圖4可知仍是木瓜蛋白酶組TBARS（1.251）最高，而單一發酵劑組（0.585）為組中最低，而戊糖片球菌與木瓜蛋白酶復配組TBARS也高為0.827，說明添加木瓜蛋白酶在促進蛋白質分解的過程中可能加速脂質的氧化。因而添加戊糖片球菌可有效抑制脂質過氧化，保證產品質量和安全性。

2.5 發酵羊肉干質構的變化

質構可整體反應產品組織狀態及食用口感。肉干硬度與嫩度呈線性負相關，硬度越大則表示咀嚼時所需力將越大，嫩度則越差；彈性表示在所受外力撤去時的回復程度；咀嚼性表示固體食品咀嚼到可吞咽時所需功，數值上等同于彈性、硬度與內聚性的乘積；內聚性表示對食品咀嚼時抵抗性[19-20]。

從表2可知，木瓜蛋白酶組和對照組硬度分別為3902.399、6729.667N，說明添加木瓜蛋白酶可顯著改善羊肉干嫩度（P＜0.05），單一組和復配組硬度分別為2418.78、4650.91N，再次說明通過添加木瓜蛋白酶可能顯著促進肌原纖維蛋白降解，進而改善羊肉干嫩度。比較4組彈性可知，木瓜蛋白酶組與單一發酵劑組彈性顯著低于對照組和復配組（P＜0.05），說明單一添加木瓜蛋白酶或發酵劑有助于促進蛋白質降解，彈性下降，而復配組彈性高于其它3組，說明復合添加酶與發酵劑可整體提高羊肉干彈性；單一組和木瓜蛋白酶組內聚性顯著低于對照組和復配組（P＜0.05），且對照組內聚性低于復配組；復配組與木瓜蛋白酶組咀嚼性差異不顯著（P＞0.05），但顯著低于其它兩組；復配組回復性顯著高于其它3組。

2.6 發酵羊肉干成品率

發酵劑及木瓜蛋白酶對發酵羊肉干加工過程成品率的影響見圖5。

羊肉中水分主要為自由水和結合水，環境條件改變有助于羊肉干中自由水向環境中遷移，結合水由于氫鍵、范德華力束縛，致使其較難丟失。因為在制作初期及腌制和發酵期，環境RH接近95%，因此此時羊肉干水分丟失較少；隨著環境溫度和RH急劇下降，促使環境與羊肉干內部形成一定濕度梯度，致使羊肉干內部水分不斷向環境中遷移，使得羊肉干在干燥期水分含量急劇下降，由于發酵劑添加使得單一組和復配組水分下降速率快于其它兩組，對照組和木瓜蛋白酶組成品相率高于其它量發酵組；在成熟過程，環境RH降到最低65%，致使羊肉干在成熟3 d下降幅度達到最大，單一組和復配組成品率降到組中最低。根據試驗制作要求，通過添加發酵劑可顯著縮短制作周期，降低制作成本。

3 討論與討論

本試驗設置木瓜蛋白酶組和單一發酵劑組，目的是對比木瓜蛋白酶在制作過程對羊肉干嫩化效果。有研究表明，在嫩肉粉中添加木瓜蛋白酶，可使得肉類食物在加熱烹煮后，口感變得較為松軟和嫩滑。木瓜蛋白酶能夠快速降解肌原纖維和結締組織，特別對于含有筋腱較多的牛肉而言，添加木瓜蛋白酶更能使得產品口感松軟、易于咀嚼。并且試驗中通過添加，有助于改善羊肉干嫩度及咀嚼特性，但其對羊肉干pH值、Aw、成品率影響較小。木瓜蛋白酶促進蛋白質降解，蛋白質分解可能對脂質氧化分解有一定貢獻作用，使得木瓜蛋白酶組羊肉干TBARS值高于其它組。試驗中通過添加具有較強抗脂質過氧化性、清除羥自由基和DPPH自由基特性的戊糖片球菌不但可快速降低羊肉干pH值、Aw，并且也有助于改善羊肉干嫩度和咀嚼特性，相比木瓜蛋白酶可有效抑制脂質過氧化，在羊肉干成熟結束單一發酵劑TBARS均低于其它三組，且低于0.6。說明添加木瓜蛋白酶可以改善羊肉干口感特性，添加發酵劑可有效抑制脂質過氧化。

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