過氧化氫參與干旱條件下脫落酸誘導黃瓜不定根形成

李雪萍，金 鑫，廖偉彪，胡琳莉

(甘肅農業大學園藝學院，甘肅 蘭州 730070)

不定根的發生對植物營養繁殖非常重要，可分為誘導、形成和表達三個連續并相互依賴的階段，每個階段均有各自的需要和特點[1]。不定根發生受諸多因素的影響，如植物激素、光照條件、營養物質和相關的應激反應等[2]。近年來，眾多信號分子被發現參與誘導不定根的發生，如一氧化氮(NO)和過氧化氫(H2O2)[3]，鈣(Ca2+)及鈣調蛋白(CaM)[4]，一氧化碳 (CO)、硫化氫(H2S)和甲烷(CH4)[5]和氫氣 (H2)[6]等。

脫落酸(ABA)和H2O2作為典型的信號分子，參與調節植物生長發育的諸多方面，如種子萌發和休眠、胚胎成熟和氣孔運動等[7-8]。ABA和H2O2作為信號分子參與植物對各種逆境脅迫的響應，如干旱、鹽及熱應激等[9]。ABA通過降低棉花葉片蒸騰速率減少植株水分散失增加其種子數和棉絨質量[10]。干旱條件下H2O2處理增強小麥抗旱性[11]并增加豌豆相對含水量緩解植株病癥[12]。廖偉彪等[13]研究發現，ABA和H2O2可以誘導3種萱草葉片氣孔關閉從而降低水分散失增強植株的抗旱性。H2O2誘導黃瓜[8]、萬壽菊[14]、菊花[15]、大豆和綠豆[16]不定根發生。ABA促進水稻主根[17]和各種豆類及非豆類側根伸長[18]，但過量ABA抑制花生[19]和水稻[20]側根的生長發育。ABA顯著促進鎘脅迫下綠豆不定根發生和伸長[21]。

干旱作為一個重要的環境因子調節植物生長發育。隨著水匱乏愈加嚴重，植物對干旱脅迫適應的研究逐漸得到關注并作為植物育種的重要目標。研究表明ABA和H2O2均參與不定根的發生并響應各種逆境脅迫。已有研究表明H2O2參與調節擬南芥保衛細胞中的ABA信號[22]。但H2O2對ABA在逆境脅迫下誘導不定根發生的作用還不清楚，因此，本研究驗證了干旱條件下H2O2對ABA誘導黃瓜外植體不定根形成的作用及相互關系，以期為H2O2參與ABA誘導植物生長發育的信號調控研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取整齊度一致的“新春四號”黃瓜種子，由甘肅省農業科學院提供。在蒸餾水中浸種6 h后轉至光照培養箱培養5 d [25℃，16 h/ 8 h (晝/夜)，200 μmol·m-2·s-1]。培養5 d后的黃瓜幼苗，在下胚軸基部切掉初生根，即為試驗用外植體。

1.2 外植體處理

黃瓜外植體培養在蒸餾水(CK)作為對照組和不同濃度的聚乙二醇(PEG，0.1，0.3，0.6和0.9%)處理液中，每個處理3次重復，每天在同一時間更換相應的處理液，處理5 d后，根據生根指標，選出中度干旱脅迫的PEG濃度用于后續試驗。試驗用化學藥劑還包括：ABA (0.01，0.05，0.1，0.5和1.0 μmol·L-1)，H2O2(200，400，600，800 和1000 μmol·L-1)，100 μmol·L-1過氧化氫酶(CAT，Sigma，USA)和1 μmol·L-1二苯基碘 (DPI)[14]。除注明外，所用試劑均為國產AR級試劑。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生根指標測定 外植體培養5 d后，以每個外植體上形成的不定根的平均根長和根數為生根形態指標。每10株黃瓜外植體為一個試驗處理，每個處理獨立重復3次。

1.3.2 氣孔開度百分比及密度測定 將黃瓜外植體培養在CK、0.3% PEG、0.3% PEG + 0.5 μmol·L-1ABA和0.3% PEG + 0.5 μmol·L-1ABA+100 μmol·L-1CAT處理液中。處理6 h后，從每個處理的3個重復中各取兩片外植體的葉片，用膠帶和解剖刀將葉片背面表皮取下，放在載玻片上，使之自然伸展并滴上碘液染色劑，蓋上蓋玻片，然后在400X光學顯微鏡下觀察。每個處理隨機選取5個不重復的視野，統計每個視野下的氣孔數并隨機測定5個氣孔的長度(內橫徑)和寬度(內縱徑)，同時測定每個視野的面積。

氣孔開度百分比=(內橫徑/內縱徑)×100%

氣孔密度=視野中氣孔的個數/視野面積

1.3.3 葉片蒸騰速率、相對含水量、細胞相對電導率和丙二醛含量測定 參照Aroca[23]等的方法稍作修改，測定葉片蒸騰速率、相對含水量、細胞相對電導率。丙二醛含量根據Han[24]等的方法進行測定。

1.3.4 滲透調節物質含量的測定 參照Storey和Jones[25]的方法稍作修改，測定脯氨酸、可溶性糖及可溶性蛋白含量。

1.3.5 酶活性測定 酶液制備：稱取0.5 g鮮樣剪碎置于研缽中(冰浴)，加2 ml磷酸緩沖液，繼續研磨成勻漿加入離心管，加5 ml磷酸緩沖液浸洗研缽，將洗液加入離心管，5000 g離心20 min。吸取上清液用磷酸緩沖液定容至25 ml于低溫下保存，以供后續試驗需要。參照Wang 等[26]方法略作改動，測定過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)活性。

1.4 數據處理

所有試驗數據使用SPSS 19.0軟件進行處理。試驗結果用3次重復的平均值±標準差(SE)表示。采用Duncan’s檢驗對各處理間的差異顯著性進行分析(P<0.05)。用Excel軟件繪制相關圖形。

2 結果與分析

2.1 PEG模擬干旱脅迫對黃瓜不定根形成的影響

不同濃度(w/v；0.1，0.3，0.6和0.9%)PEG處理顯著影響黃瓜外植體不定根根數和根長。隨著PEG濃度的增大，根數和根長分別從6.6個/株和4.6 cm降低到0.67個/株和0.34 cm。0.1% PEG處理的外植體根數和根長與CK相比分別降低了25.8%和34.8%， 0.3% PEG處理的外植體與CK相比根數和根長分別降低了57.6%和67.4%，而0.6%和0.9% PEG處理的外植體根數與CK比較分別降低了79.2%和89.8%，根長分別降低了90.7%和92.6%(圖1)。因此，在本試驗中0.1% PEG為輕度干旱脅迫，0.3% PEG為中度干旱脅迫，0.6%和0.9% PEG為重度干旱脅迫。在后面的試驗中選用0.3%作為模擬干旱脅迫的PEG濃度。

2.2 不同濃度ABA和H2O2對干旱條件下黃瓜不定根形成的影響

在干旱條件下ABA和H2O2對黃瓜不定根的形成都有影響，而且呈明顯的濃度依賴效應(圖2)。干旱脅迫下0.01，0.05，0.1，1.0 μmol·L-1ABA和200，400，600，1000 μmol·L-1H2O2處理外植體的根數和根長高于PEG單獨處理，但是顯著低于CK。而干旱脅迫下0.5 μmol·L-1ABA和800 μmol·L-1H2O2處理的外植體根數和根長顯著高于ABA和H2O2其它濃度處理外植體的根數和根長(圖2)。因此，干旱脅迫下促進黃瓜外植體不定根形成的最適宜ABA和H2O2濃度分別為0.5 μmol·L-1和800 μmol·L-1，即作為后續試驗所用濃度。

2.3 CAT和DPI對干旱脅迫下ABA誘導黃瓜不定根形成的影響

從圖3可以看出，PEG單獨處理外植體不定根的根數和根長與CK相比分別降低了62.5%和15.7%；CAT或DPI分別與PEG共處理時，不定根根數和根長都顯著低于PEG單獨處理；ABA或H2O2分別與PEG共處理外植體時，不定根的根數和根長都顯著高于PEG且分別高出109%和27.9%；而ABA和H2O2在干旱條件下共處理時，不定根根數和根長都高于ABA或H2O2單獨處理，且ABA和H2O2共處理較ABA或H2O2單獨處理的根數分別高出31.3%和19.3%；CAT或DPI與ABA共處理外植體與ABA單獨處理的外植體相比，不定根根數分別降低了15.2%和30.9%，根長分別降低了24.1%和26%。以上結果可以看出干旱脅迫抑制外植體不定根的發生，外源ABA或H2O2可以顯著促進干旱脅迫下不定根的發生，而CAT或DPI處理清除內源H2O2后，ABA促進不定根生長的效果被顯著抑制，說明H2O2參與ABA誘導黃瓜不定根的發生。

注：不同字母表示不同處理間的差異顯著(P<0.05)。下同。 Note: Different letters indicate significant difference in different treatments at P<0.05. The same as below.圖1 不同濃度的PEG對黃瓜外植體不定根形成的影響Fig.1 Effect of different concentrations of PEG on adventitious root development in cucumber explants

圖2 不同濃度的ABA 和H2O2對干旱脅迫下黃瓜不定根形成的影響Fig.2 Effects of different concentrations of ABA or H2O2 on adventitious root development in cucumber explants under drought stress

圖3 CAT和DPI對干旱條件下ABA誘導不定根形成的影響Fig.3 Effects of CAT or DPI on adventitious root development induced by ABA under drought stress

2.4 CAT對干旱脅迫下ABA誘導黃瓜不定根發生中葉片氣孔、蒸騰速率及相對含水量的影響

由圖4A和圖4B可以看出，PEG處理后黃瓜外植體葉片的氣孔開度的百分比與氣孔密度都顯著高于CK，分別高出13%和7.2%；PEG和ABA共處理與PEG單獨處理相比，氣孔開度百分比和氣孔密度分別降低了24.2%和15.4%；而當CAT與PEG和ABA共處理，將內源H2O2清除，氣孔開度百分比和氣孔密度增加，而且顯著高于PEG和ABA共處理。CK、PEG、PEG+ABA和PEG+ABA+CAT四個處理之間的蒸騰速率在30 min之前沒有顯著性差異(圖4C)；在60～90 min之間，PEG+ABA處理的蒸騰速率呈下降趨勢而其它處理呈上升趨勢，并且在90 min時PEG+ABA處理的蒸騰速率顯著低于PEG單獨處理和PEG+ABA+CAT處理；在90～120 min時，所有處理的蒸騰速率都上升，但是PEG+ABA處理的蒸騰速率還是顯著低于PEG和PEG+ABA+CAT處理(圖4C)；以上結果顯示CAT處理清除內源H2O2可以顯著抑制干旱脅迫下ABA對植株葉片蒸騰速率的降低效果。四個處理的相對含水量在0 d和1 d都沒有顯著差異(圖4D)。在2 d和3 d時，與CK相比PEG處理的相對含水量顯著降低，PEG+ABA處理的相對含水量顯著高于PEG單獨處理，PEG+ABA+CAT處理的相對含水量顯著高于PEG+ABA處理。在處理2 d時，與CK相比PEG的相對含水量降低了26%；與PEG相比PEG+ABA處理的相對含水量增加了25%；與PEG+ABA處理相比PEG+ABA+CAT的相對含水量降低了9%。這些結果表明，ABA增加干旱條件下不定根發生過程中相對含水量，而PEG+ABA+CAT明顯逆轉了ABA的作用效果。上述結果說明內源H2O2可能參與ABA調節干旱條件下黃瓜外植體在不定根發生過程中葉片的氣孔關閉和水分散失。

圖4 ABA和CAT對干旱條件下黃瓜外植體在不定根發生過程中葉片氣孔開度、密度、蒸騰速率和相對含水量的影響Fig.4 Effects of ABA and CAT on stomatal aperture and density, transpiration rate and relative water content of cucumber explants leaves under drought stress

2.5 CAT對干旱脅迫下ABA誘導黃瓜不定根發生中細胞膜穩定性的影響

四個處理的相對電導率在0～12 h呈上升趨勢；但在0～8 h各處理的相對電導率無顯著差異。在12 h時，PEG單獨處理的相對電導率比CK升高14.3%，而ABA處理后相對電導率比PEG單獨處理降低了14.2%， PEG+ABA+CAT處理的相對電導率比PEG+ABA處理增加7.8%；12 h之后，四個處理的相對電導率均呈下降趨勢，且24 h時PEG+ABA處理的相對電導率顯著低于PEG和PEG+ABA+CAT處理(圖5A)。從圖5B可以看出，不同處理黃瓜外植體的MDA含量均呈先緩慢上升后急劇下降的變化趨勢。在0～8 h四個處理之間沒有差異，在8～24 h之間PEG處理的MDA含量顯著高于CK，在12～24 h之間PEG+ABA處理的MDA含量顯著低于PEG處理，24～48 h之間四個處理的MDA含量均呈下降趨勢。上述結果表明，PEG處理增加相對電導率與MDA含量，在干旱脅迫下ABA處理可以降低相對電導率與MDA含量，而CAT處理顯著增加了相對電導率，說明ABA可以降低由于干旱脅迫造成的相對電導率和MDA含量的增加，而CAT可以逆轉ABA的作用效果。

圖5 ABA和CAT對干旱脅迫下黃瓜外植體相對電導率和丙二醛含量變化的影響Fig.5 Effects of ABA and CAT on relative conductivity and MDA content in cucumber explants under drought stress

2.6 CAT對干旱脅迫下ABA誘導黃瓜不定根發生中外植體滲透調節物質的影響

圖6A顯示，處理4 h前，四個處理均呈下降趨勢，4～8 h之間只有PEG處理呈上升趨勢，其它處理均呈下降趨勢，8～12 h之間四個處理的可溶性糖含量均大幅上升。CK的可溶性糖含量在0 h時達到峰值，為0.32 mg·g-1，而其它3個處理的可溶性糖含量峰值在12 h時出現，并且顯著高于CK。在12 h之后，四個處理均呈大幅下降趨勢，48 h時呈穩定狀態。從四個處理的可溶性糖含量變化趨勢可以看出，PEG處理后，隨著脅迫時間的延長，植株可溶性糖含量逐漸降低；而與PEG單獨處理相比，PEG+ABA處理植株的可溶性糖含量增加了；CAT處理將內源H2O2清除，植株可溶性糖含量在一定時間內低于PEG+ABA處理，說明內源H2O2和ABA提高干旱脅迫下外植體可溶性糖含量。

除了PEG處理在8～12 h之間可溶性蛋白含量出現下降趨勢，其它3個處理均呈先上升后下降的趨勢。在24 h時4個處理的可溶性蛋白含量均出現峰值，PEG+ABA的峰值最大，是19.4 mg·g-1；PEG+ABA+CAT處理為18.9 mg·g-1；PEG處理含量最低為12.7 mg·g-1。在24 h之后，四個處理均呈現急劇下降趨勢，但是PEG+ABA處理的可溶性蛋白含量仍然最大(圖6B)。在整個試驗過程中，PEG+ABA處理的可溶性蛋白含量始終高于其它3個處理，說明ABA和內源H2O2提高了干旱脅迫下黃瓜外植體可溶性蛋白的含量。

從圖6C可以看出，四個處理的游離脯氨酸含量的變化趨勢基本一致，都是呈先上升后下降的趨勢。在0～8 h除了PEG+ABA處理脯氨酸含量下降，其它處理均呈上升趨勢；8～12 h四個處理均呈大幅上升趨勢，12～24h四個處理均呈下降趨勢，且在整個試驗中PEG+ABA處理的脯氨酸含量均高于CK和PEG單獨處理。在12 h時，CK、PEG、PEG+ABA和PEG+ABA+CAT四個處理的脯氨酸達到峰值，分別是159.3、102.1、171.5和162.3 mg·g-1。從四個處理的峰值可以看出，PEG+ABA處理的脯氨酸含量最高，而CAT處理后脯氨酸含量下降，說明CAT將內源H2O2清除后影響了外植體脯氨酸含量，即內源H2O2參與ABA增加干旱脅迫下黃瓜外植體脯氨酸含量的過程。

2.7 CAT對干旱脅迫下ABA誘導黃瓜不定根發生中POD、PPO和IAAO酶活性的影響

在0～8 h，四個處理的POD活性顯著增加(圖7A)。在8～12 h，PEG處理的POD活性顯著降低，而其它處理的均保持相對平穩，且PEG+ABA處理的POD活性顯著高于PEG和PEG+ABA+CAT處理。在12 h時，PEG+ABA處理比PEG單獨處理的POD活性增加了49.1%；PEG+ABA+CAT處理的POD活性比PEG+ABA處理降低了12.3%(圖7A)。圖7B顯示，PEG+ABA和PEG+ABA+CAT處理的PPO活性曲線是雙峰曲線，兩個峰值分別出現在4h和24 h。在4～8 h和24～48 h，PEG+ABA處理的PPO活性顯著高于PEG單獨處理。在4 h時，PEG+ABA處理的PPO活性比PEG單獨處理高出24.47%。在48 h時，與PEG+ABA處理相比PEG+ABA+CAT處理的PPO活性降低了31.01%。四個處理的IAAO活性在整個試驗過程中，呈先上升后下降的趨勢(圖7C)。在4～12 h，PEG+ABA和PEG+ABA+CAT處理的IAAO活性顯著高于PEG單獨處理。在12 h時，PEG、PEG+ABA和PEG+ABA+CAT處理的IAAO活性達到峰值，且PEG+ABA處理的IAAO活性較PEG單獨處理高16.86%，而PEG+ABA+CAT處理的IAAO活性較PEG+ABA處理低5.38%(圖7C)。

圖6 ABA和CAT對干旱脅迫下黃瓜外植體滲透調節物質變化的影響Fig.6 Effects of ABA and CAT on osmotic regulation substances in cucumber explants under drought stress

圖7 ABA和CAT對干旱脅迫下黃瓜外植體POD、PPO和IAAO酶活性變化的影響Fig.7 Effects of ABA and CAT on POD、PPO and IAAO activity in cucumber explants under drought stress

3 討 論

ABA預處理促進鎘脅迫下綠豆不定根形成和伸長[21]。本研究中，適宜濃度的ABA處理可以顯著增加干旱脅迫下不定根根數和根長(圖2A和2B)，說明ABA可以促進干旱條件下不定根的發生。因此，ABA可能參與逆境脅迫下植物的生長發育。與ABA一樣，外源H2O2可以緩解干旱脅迫對不定根的抑制效果(圖2C和2D)。我們實驗室之前的研究結果表明干旱脅迫下H2O2可促進萬壽菊不定根發生[3]。因此，ABA和 H2O2均能促進干旱條件下不定根發生。本研究中，CAT和DPI均能逆轉干旱脅迫下ABA對不定根發生的促進效果(圖3)，說明內源H2O2的減少會減弱干旱脅迫下ABA對不定根發生的促進效果。ABA誘導 H2O2產生導致擬南芥氣孔關閉[22]，表明H2O2對ABA信號轉導有中間調節作用。本研究表明，干旱脅迫下H2O2參與ABA促進不定根發生，且提出ABA降低干旱脅迫對不定根發生抑制作用的信號轉導途徑需要H2O2參與。

干旱脅迫誘導氣孔關閉降低蒸騰速率，蒸騰速率降低有利于保持較高的水分含量與植物抗旱性有關。本研究中，干旱脅迫下ABA顯著降低黃瓜葉片氣孔開度百分比、密度和蒸騰速率同時提高相對含水量(圖4)，顯著增加了干旱脅迫下不定根根數和根長(圖2A和2B)。ABA降低干旱脅迫下棉花葉片蒸騰速率[10]、誘導葉表皮的氣孔關閉[11]降低水分散失增強植物的抗旱性，說明ABA增強植物的抗旱性通過調節其水分含量。本研究中，CAT逆轉了ABA對氣孔開度、密度、蒸騰速率和相對含水量的效果(圖4)，表明H2O2參與干旱脅迫下黃瓜不定根發生過程中ABA對水分平衡的調節。

環境脅迫會對植物細胞質膜造成一定的傷害，生成具有強氧化性的脂質過氧化物和各種小分子的降解物，其中變化最顯著的是MDA，因此MDA的濃度是檢測植物膜傷害的一個重要指標[27]。本研究中，干旱脅迫下黃瓜外植體不定根發生過程中的相對電導率和MDA含量均升高(圖5)，說明干旱脅迫破壞了外植體葉片的膜穩定性。干旱條件下ABA處理的相對電導率和MDA含量均顯著降低，而CAT處理清除內源H2O2后逆轉了ABA的作用效果 (圖5)，說明內源H2O2參與干旱條件下不定根發生過程中ABA對外植體細胞內環境穩定性的維持，進而緩解了干旱脅迫對細胞膜造成的傷害。

干旱脅迫下H2O2通過增加可溶性糖和可溶性蛋白促進萬壽菊不定根發生[3]。本研究中，ABA處理的脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量顯著高于PEG單獨處理(圖6)，說明干旱脅迫下ABA促進滲透調節物質的積累。而CAT處理逆轉了ABA的作用效果(圖6)，說明在干旱脅迫下內源H2O2有利于ABA促進植株體內滲透調節物質的積累。因此，干旱脅迫下ABA和H2O2促進不定根發生可能與滲透調節物質脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的增加有關。POD、PPO和IAAO是分析生根相關的組織形態變化階段有用的生根相關酶。本研究中ABA通過增加POD、PPO和IAAO活性(圖7)促進干旱條件下不定根發生(圖2A和2B)，而這些酶活性被CAT抑制(圖7)。H2O2顯著增加菊花插條不定根形成中POD、PPO和IAAO活性[15]。H2O2顯著增加低溫脅迫下馬鈴薯的POD和PPO活性以緩解受到的損傷[28]。上述結果表明，在逆境條件下ABA增加不定根發生中POD、PPO和IAAO活性。綜上所述，在干旱脅迫下不定根發生過程中內源H2O2可能參與ABA增加脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量及POD、PPO和IAAO活性的增加。

概而言之，本研究提出了內源H2O2參與干旱條件下ABA促進不定根發生的新觀點。且內源H2O2參與ABA緩解干旱脅迫對氣孔開度和密度、蒸騰速率、相對電導率、MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的負作用。因此，干旱條件下不定根形成過程中ABA可能通過H2O2的作用提高自己的信號水平，而關于不定根形成過程中H2O2參與ABA的信號轉導網絡仍然知之甚少。因此，本研究對了解H2O2在逆境脅迫下ABA的信號途徑中的作用有重要意義，但仍需更多的進一步研究去揭示H2O2參與ABA調節植物生長發育的信號調控機理。

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