黃瓜枯萎病拮抗菌的拮抗促生因子檢測及生物效應研究

馬 興，董星晨，張 健，羅超越，鄧德雷，張春紅，王友玲，邱慧珍

(甘肅農業大學資源與環境學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

黃瓜是具有較高經濟價值的重要蔬菜作物[1]，中國的黃瓜種植面積和總產量一直位于世界首位。甘肅省是我國北方黃瓜的主要種植區[2]，2014年種植面積達到2.33萬hm2[3]。近年來，黃瓜高密度、高復指數的種植模式使其土傳病害頻繁發生，尤其是由尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(FOC,Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)侵染引起的黃瓜枯萎病，是一種極具毀滅性的土傳真菌病害[4-5]，在我國北方黃瓜主要種植區該病造成黃瓜產量下降10%～30%，嚴重時可達80%～90%，給種植者帶來極大的經濟損失[6-7]。

目前黃瓜枯萎病的防治方法主要采用化學防治[8]、物理防治[9]、農業防治[10]及生物防治[11]等方法，其中以藥劑為主導的化學防治是控制黃瓜枯萎病的重要手段，但是長期的化學防治會使病原菌產生抗性，導致防治效果衰退，而且化學藥劑在使用過程中易在土壤中殘留，會造成土壤微生物區系的破壞和多樣性下降等一系列土壤健康問題，其嚴重阻礙了黃瓜產業的健康和可持續發展[12-14]。

相對于化學防治，生物防治是利用高效功能微生物對黃瓜枯萎病進行防治，是一種對環境無污染，對人畜無毒，對土壤中有益微生物無影響，對黃瓜無副作用，且尖孢鐮刀菌不易產生抗性，使用成本較低的防治方法[15-17]。目前已有許多生防菌劑用于植物病蟲害的防治，取得了可觀的成效，其中研究最多的高效功能微生物類群有：熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)、木霉屬(Trichodermaspp.)[18]。據研究報道枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)制成的生物有機肥對棉花黃萎病的防治效果達到39%以上[19]；俞魯等[20]篩選的芽孢桿菌，其生物有機肥對香蕉枯萎病的防治效果達到74%；有學者用解淀粉芽孢桿菌Th-1防治西瓜枯萎病，其盆栽試驗結果發現：添加菌株Th-1的處理與對照相比防治效果增加78.5%[21]；Perze-Vicente等的研究發現：功能微生物——哈茨木霉與抗病品種的結合，使香蕉枯萎病的防治效果達到95%[22]；有研究針對辣椒青枯病(Ralstoniasolanacarum)篩選拮抗菌，得到一株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，其對辣椒青枯病的防治效果很好[23]。對于生物防治，高效功能微生物是其關鍵因子[1]。

本研究采集了黃瓜蔬菜大棚枯萎病發病地塊的健康植株根際土和根系，通過分離、篩選，得到2株對尖孢鐮刀菌黃瓜專化型有穩定抑制作用的菌株QHZ-Yb1和QHZ-Yb2(以下簡稱Yb1和Yb2)并對2株菌進行了鑒定，探索了其潛在的拮抗促生因子，檢驗了其對黃瓜種子萌發的影響及對植株防病和促生的效果，旨在為黃瓜枯萎病的生物防治及植株健壯生長提供優良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃瓜枯萎病病原菌：尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(FOC,Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)由本實驗室提供。

培養基LB、PDA、尖孢鐮刀菌選擇性培養基的配制，采用凌寧等的方法[24]。

菌株DNA提取試劑盒購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 拮抗菌的篩選

2014年9月在甘肅省白銀市白銀區，采集黃瓜蔬菜大棚枯萎病發病地塊的健康植株根際土和根系。稱取根際土和根系共5 g，其中根系用無菌剪刀剪成1 mm的小段，進行梯度稀釋，取10-4、10-5、10-6的稀釋液0.1 mL涂布，28 ℃恒溫培養3 d后挑選形態各異的菌落，純化后采用平板對峙法篩選拮抗菌，平板對峙法參照文獻[12]。

1.3 拮抗菌的鑒定

拮抗菌傳統的形態、生理生化鑒定參照《微生物學實驗技術》的方法[25-26]。

菌株16S rDNA序列測定及分析：采用Ezup柱式基因組細菌DNA抽提試劑盒(Sangon Biotech, Shanghai, China)，按照說明書的步驟提取細菌DNA。使用PCR對樣品16S rDNA進行擴增，引物為：27F、1492R[27]。PCR反應程序：95 ℃ 5 min；94℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30次循環；72 ℃ 7 min，4 ℃條件下，將PCR產物進行純化后交南京金斯瑞生物科技有限公司(Genscript，Nanjing，China)進行測序，測序結果在NCBI基因數據庫中進行BLAST比對，同時使用軟件MEGA7.0構建系統發育樹。

1.4 拮抗菌拮抗促生因子檢測

1.4.1 拮抗菌脂肽類粗提取物的抑菌效果測定 打取直徑5 mm的黃瓜枯萎病病原菌菌餅接于PDA固體平板中央，將牛津杯放置于距中央2.5 cm處，每皿放置4個，每個牛津杯中加100 μL提取物，3次重復，25 ℃恒溫培養7 d后，計算其抑菌率，拮抗菌脂肽類物質粗提取參照文獻[28]。

1.4.2 拮抗菌分泌IAA的測定 將活化后的菌株分別接種至LB液體培養基中(每升LB液體培養基中含色氨酸5 mmol)，28±2℃，170 r/min搖床培養2 d，取適量菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL于10 mL無菌離心管中，加入Salkawski’s顯色劑顯色，以不接菌的培養基為對照，30 min后對比觀察顏色變化。定量測定：將活化后的菌株分別接種至LB液體培養基中(每升LB液體培養基中含色氨酸5 mmol)，28±2 ℃，170 r/min搖床培養2 d，取適量菌液，10 000 r·min-1離心10 min，取上清液1 mL于10 mL無菌離心管中，加入PC顯色劑[29]2 mL，30 min后，測定OD530值，以空白培養基為對照，用純的IAA作標準曲線，計算菌株產IAA的量。

1.4.3 拮抗菌溶P能力測定 定性測定：將菌株點接于Pikovaskaia[30]固體平板上，每皿點接3次，3次重復，28±2 ℃恒溫培養7 d，觀察菌株是否形成溶磷圈。定量測定：制備108cell/mL的菌懸液，OD600≈ 2，分別接種各菌液1mL置100mL Pikovaskaia液體培養基中，28±2 ℃，170r/min搖床培養14d，取菌液于50mL的離心管，低溫4 ℃，10000r/min，離心20min，以不接菌的Pikovaskaia液體培養基作對照，用鉬銻抗比色法測定上清液中有效P含量[30]。

1.4.4 拮抗菌產嗜鐵素的測定 在LB液體培養基中，接種活化后的菌株，28±2 ℃，170 r/min搖床培養12 h，離心，獲取上清液，按1∶1比例取菌株上清液和CAS顯色液[31]混合，顯色2 h，以不接菌的培養基作對照，3次重復，若培養基顏色改變，則有嗜鐵素產生。

1.4.5 拮抗菌產酪蛋白酶的測定 將活化后的菌株點接于酪蛋白固體培養基[32]，每皿點接3次，3次重復，28±2 ℃恒溫培養，觀察菌株周圍有無透明圈產生。

1.5 菌液對黃瓜種子萌發的影響

將黃瓜種子置于60 ℃熱水中，緩慢攪拌10 min，再用1%次氯酸鈉溶液處理1 min，最后用無菌水反復沖洗。分別接種菌株Yb1和Yb2于LB液體培養基中，28±2 ℃，170 r/min搖床恒溫培養20 h，OD600≈ 2，分別吸取1 mL均勻置于墊有無菌濕潤濾紙的培養皿內，每皿放置10粒大小均等的黃瓜種子，3次重復，再將培養皿置于28±2 ℃恒溫培養箱36 h(期間定期加1～2 mL無菌水保持培養皿內濕度)，對照加等量LB液體培養基，觀察出芽長度。

1.6 拮抗菌生物效應研究

盆栽試驗用土：用健康的大田土，土壤基本理化性狀：有機質7.47 g·kg-1，堿解氮16.30 mg·kg-1，速效磷25.8 mg·kg-1，速效鉀350.84 mg·kg-1，pH為7.84。盆栽試驗共設4個處理：T1,對照(CK)；T2,+Yb1菌懸液；T3,+Yb2菌懸液；T4,+(Yb1+Yb2)菌懸液。12盆/處理，3株/盆，5 kg土/盆，常規的水肥管理，所有處理均在黃瓜移栽前7 d接種3.29×104CFU/g尖孢鐮刀菌黃瓜專化型孢子，移栽時各處理均勻拌入菌懸液，加菌量達到0.8×106CFU/g。

黃瓜種子用60 ℃溫水和5%過氧化氫消毒后催芽育苗，在育苗盤育苗30 d后移栽于盆缽，移栽后觀察記錄植株生長和發病狀況，在移栽60d時，測定不同處理黃瓜植株的生物量[17]并計算各處理枯萎病的發病率及防治效果，測定根際可培養微生物的數量[20]。發病率(%)=發病植株/調查總株數×100%，防治效果=(對照發病率-處理發病率)/對照發病率×100%[14]。

采用SPSS 20進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選結果

通過7d對峙試驗得到2株對黃瓜枯萎病病原菌具有顯著抑制作用的菌株Yb1和Yb2，抑菌帶寬度達3.37 mm和3.42 mm，抑菌圈直徑>2.7 cm，抑菌率分別達到61.9%和62.3%(圖1)。

2.2 菌株的鑒定結果

2.2.1 菌株的形態特征結果 菌株Yb1和Yb2在LB平板培養基上，28±2 ℃，培養24 h，均可呈現明顯菌落。Yb1菌落呈圓形、乳白色、不透明、表面褶皺、邊緣為波狀；Yb2菌落呈圓形、乳白色、不透明、表面有褶皺、邊緣不整齊；3 d后兩菌落均成褐色。菌株Yb1和Yb2革蘭氏染色均呈陽性，均為中生芽孢。

2.2.2 菌株生理生化特性的測定結果 對菌株Yb1和Yb2進行生理生化特性的測定，結果見表1。通過自動檢索數據庫比對測定結果，結果表明Yb1和Yb2均屬于芽孢桿菌屬。

2.2.3 菌株16S rDNA序列分析結果 菌株Yb1和Yb2的16SrDNA序列長度分別為1412 bp和1417 bp。在NCBI基因數據庫中進行BLAST比對，繪制系統發育樹(圖3)。結果表明：菌株Yb1與萎縮芽孢桿菌BacillusatrophaeusstrainJCM9070NR—024689.1的親緣性最高(圖3A)，菌株Yb2與萎縮芽孢桿菌BacillusatrophaeusstrainNBRC15539NR112723.1的親緣性最高(圖3B)，結合菌株的形態特征及生理生化測定結果，初步確定Yb1和Yb2均為萎縮芽孢桿菌(B.atrophaeus)。

圖1 菌株Yb1(a)和Yb2(b)對黃瓜枯萎病病原菌生長的影響(7 d)Fig.1 Effects of Yb1 (a) and Yb2 (b) on the growth of Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum(7 d)

(a)Yb1菌落形態；(b)Yb1革蘭氏染色；(c)Yb1芽孢染色；(d)Yb2菌落形態；(e)Yb2革蘭氏染色；(f)Yb2芽孢染色(a)Colonial morphology of strainYb1; (b)Gram stain of strain Yb1; (c)Spore staining of strainYb1; (d)Colonial morphology of strain Yb2; (e)Gram stain of strain Yb2; (f)Spore staining of strain Yb2圖2 菌株Yb1和Yb2形態學鑒定Fig.2 Morphological identifications of Yb1 and Yb2

測定指標Test index試驗結果 ResultYb1Yb2測定指標Test index試驗結果 ResultYb1Yb2葡萄糖 Glucose++產H2S Sulfuretted hydrogen++果糖 Fructose++產吲哚乙酸 Indole++蔗糖 Sucrose++尿素水解 Urea hydrolysis+-淀粉 Starch++檸檬酸 Citric acid++甘油 Glycerol++苯丙氨酸 Phenylalanine+-V-P試驗 V-P test++色氨酸Tryptophane++M-R試驗 M-R test--酪氨酸 Tyrosine++淀粉水解 Amylolysis++接觸酶 Catalase++明膠液化 Gelatine liquefication++硝酸鹽還原 Nitrate reduction++產氨 Production of ammonia++石蕊牛奶試驗 Litmus milk test++

注：+：陽性反應；-：陰性反應。 Note:+:positive reaction;-:negative reaction.

圖3 Yb1(A)和Yb2(B)系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of Yb1 and Yb2

2.3 菌株拮抗促生因子檢測結果

2.3.1 菌株脂肽類粗提取物的抑菌效果 菌株Yb1和Yb2脂肽類粗提物的抑菌效果如圖4，抑菌率分別為57.4%和58.0%。

2.3.2 菌株分泌IAA的測定結果 如圖5結果顯示，加入Salkawski’s顯色劑，顯色30 min后，菌株Yb1和Yb2的上清液均較CK顏色變深，說明菌株Yb1和Yb2均分泌IAA。定量測定結果表明，菌株Yb1和Yb2分泌IAA的量分別為1.56 mg·L-1，3.69 mg·L-1。

圖4 Yb1(a)和Yb2(b)脂肽類粗提物對黃瓜枯萎病病原菌生長的影響Fig.4 Effects of lipopeptide from Yb1(a) and Yb2(b)on the growth of pathogen of cucumber wilt

圖5 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產IAAFig.5 IAA produced from Yb1(a) and Yb2(b)

2.3.3 菌株溶P能力測定結果 圖6結果顯示，在菌株Yb1和Yb2的菌落周圍有明顯的溶磷圈，且后者顯著大于前者，定量測定結果表明，菌株Yb1和Yb2的溶磷量分別為0.77 mg·L-1和1.19 mg·L-1。

2.3.4 菌株產嗜鐵素的測定結果 如圖7結果顯示，對比CK，菌株Yb1和Yb2的上清液顏色改變，說明菌株Yb1和Yb2均產嗜鐵素。

2.3.5 菌株產蛋白酶的測定結果 點接在酪蛋白培養基(圖8)上的Yb1和Yb2菌株周圍均有明顯的透明圈產生，說明兩菌株均有產酪蛋白酶的能力且Yb2菌株產酪蛋白酶的能力強于Yb1。

圖6 菌株Yb1和Yb2溶PFig.6 Phosphorus solubilization from Yb1 and Yb2

圖7 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產嗜鐵素Fig.7 Siderophore produced from Yb1(a) and Yb2(b)

2.4 菌液對黃瓜種子萌發的影響結果

如圖9所示，黃瓜種子催芽36 h后，接種Yb1和Yb2菌液的黃瓜種子出芽長度明顯長于CK，說明菌株Yb1和Yb2均能促進黃瓜種子的萌發及芽的生長。

2.5 拮抗菌生物效應研究結果

如表2所示，對比CK，Yb1、Yb2、Yb1+Yb2菌懸液的處理不僅對黃瓜枯萎病有不同程度的生防效果，而且均使植株生物量增加。對比CK，Yb1和Yb2菌懸液無論是單獨使用還是加和在一起使用，都使黃瓜枯萎病的發病率降低5.0%以上，防治效果達到6.0%以上，其中Yb1+Yb2菌懸液的處理使黃瓜枯萎病的發病率降低了11.11個百分點。黃瓜移栽后60 d，接種Yb1、Yb2和Yb1+Yb2菌懸液處理的株高分別比CK增加了52.1%、34.0%和73.7%，植株干重增加了17.9%、8.9%和56.7%，植株地上部和根系干重分別增加了15.97%和6.14%、53.07%和61.11%、77.78%和138.89%。可以看出，Yb1和Yb2無論對黃瓜植株地上部還是根系生長的促進作用，均具有明顯的加和效果。

各處理對黃瓜根際土中可培養微生物數量的計數結果如表3所示。可以看出，與CK相比，Yb1、Yb2和Yb1+Yb2菌懸液處理的黃瓜植株根際土中的細菌、放線菌數量明顯增加，真菌和尖孢鐮刀菌數顯著減少，說明拮抗菌Yb1和Yb2能夠抑制病原菌的數量，使根際微生物區系向健康轉變，有利于降低植株發病率而且加和效果突出。

圖8 菌株Yb1(a)和Yb2(b)產蛋白酶Fig.8 Casease produced from Yb1(a) and Yb2(b)

圖9 菌株Yb1(a)和Yb2(b)對黃瓜種子萌發的影響Fig.9 Effects of the strains of Yb1(a) and Yb2 (b) on cucumber seed germination

處理Treatment發病率Incidence of disease/%防治效果Control efficiency/%株高Plant height/cmPlant dry weight/g地上部干重Shootdry weight/g地下部干重Underground dry weight/gCK80.55±4.81a--48.50±2.52d4.25±0.10c4.07±0.11c0.18±0.03dYb175.00±0.00ab6.9073.75±2.87b5.01±0.08b4.72±0.06b0.29±0.02cYb272.22±4.81b10.3465.00±2.94c4.63±0.39b4.32±0.38b0.32±0.03bYb1+ Yb269.44±2.73b13.7984.25±3.78a6.66±0.12a6.23±0.14a0.43±0.02a

注：同列數值后不同字母表示差異達5%顯著水平。下同。

Note:Values followed by different small letters in the same column mean significant at 5% level. The same as below.

表3 不同處理對黃瓜根際土中可培養微生物數量的影響

3 結論與討論

芽孢桿菌是一類重要的生防菌，不僅對植物病害有防治作用而且能夠促進植物的生長發育[33]。有研究發現枯草芽孢桿菌B29，其菌劑(7×106CFU·mL-1)對黃瓜枯萎病的田間防效達84.9%，增產12.57%[34]。據研究報道生防菌CT205不僅對黃瓜生長有促進作用而且對黃瓜枯萎病的防治效果達到51.85%[35]。有研究者對幾株芽孢桿菌的促生能力進行了研究，結果發現其對溫室條件下的玉米和番茄有顯著的促生作用[36]。本研究通過平板對峙試驗篩選到2株拮抗效果好的菌株：Yb1和Yb2，通過形態學結合生理生化及菌株16S rDNA序列分析，初步確定這兩株菌均為萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)。

生防芽孢桿菌通過產生抗菌物質及其它生防機制共同或單獨作用發揮良好的生防效果[37]。生防芽孢桿菌發揮抗菌作用抑制病原菌主要源于其分泌的脂肽類抗生素，包括伊枯草素(Iturin)、泛革素(Fengycin)和表面活性素(Surfactin)三大類脂肽[38]。陳莉的研究發現萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)B44產生的iturin A是關鍵的抑菌活性物質，菌株B44在田間條件下，對棉苗立枯病、棉花黃萎病、加工番茄根腐病均有良好的生防治效果[39]。生防菌Bs-916分泌的脂肽類化合物BacillomycinL，用500 μg·mL-1防治水稻紋枯病和苗瘟，防效分別為70.8%和56.3%[40]。生防芽孢桿菌也可以通過分泌細胞壁降解酶抑制病原菌的生長[41]以及通過產嗜鐵素，在與病原菌競爭鐵元素時占據絕對優勢，使病原菌因缺鐵而生長異常，進而起到生防作用[38]。研究發現菌株Yb1和Yb2的脂肽類粗提取物(用量：100 μL)對黃瓜枯萎病病原菌的抑菌率分別達到57.4%和58.0%，且均產蛋白酶和嗜鐵素，菌株Yb2產蛋白酶的能力較Yb1強，說明菌株Yb1和Yb2具有良好的生防潛力，Yb2的防治效果或許強于Yb1；盆栽試驗檢驗菌株Yb1和Yb2的生防能力發現：Yb1、Yb2及Yb1+Yb2菌懸液處理對黃瓜枯萎病的防治效果分別為6.9%、10.34%、13.79%，菌株Yb2的生防效果較Yb1好，這與菌株平板對峙試驗和菌株脂肽類粗提取物的抑菌效果及酪蛋白酶的分泌量結果一致；Yb1+Yb2菌懸液處理的生防效果最好，說明兩菌株具有加和效應。

有些生防芽孢桿菌通過促進植物生長間接的發揮其生防作用[42]，其促生機制包括：產生長素(IAA)促進植物生長、產嗜鐵素將多余的鐵元素供給植物、溶磷使土壤中無效態磷轉化成有效態磷[43]等。菌株Yb1和Yb2既能分泌生長素(IAA)，也可溶磷并產嗜鐵素，通過種子發芽試驗及盆栽試驗檢驗其防病和促生能力發現：菌株Yb1和Yb2對黃瓜種子的萌發有促進作用。盆栽試驗結果表明：對比CK，Yb1、Yb2及Yb1+Yb2菌懸液處理均使黃瓜植株生物量增加，株高分別增加了52.1%、34.0%、73.7%，植株干重增加了17.9%，8.9%和56.7%，植株地上部和根系干重分別增加了15.97%、6.14%、53.07%，61.11%、77.78%、138.89%。以上說明，菌株Yb1和Yb2對黃瓜植株地上部及根系生長具有促進作用且有明顯的加和效應；株高和植株地上部干重的增加量Yb1>Yb2，根系干重的增加量Yb2>Yb1，這可能與菌株促生機制的主要作用部位和產生量有關。

根際是病原微生物和有益微生物的運動場和戰場[44]，根際病原微生物和有益微生物的數量和密度對植物生長和健康有非常重要的影響[45-46]。健康的根際體系，微生物群體相對平衡，這種平衡一旦被打破，有益微生物減少，病原微生物增加，從而導致植物病害產生及作物產量下降[47]。在土壤中添加有益微生物，不僅改善根際微生物群體的相對平衡，而且有利于防治植物病害。盆栽試驗的結果表明：與CK相比，Yb1、Yb2及Yb1+Yb菌懸液處理尖孢鐮刀菌及真菌數量明顯減少，細菌和放線菌的數量增加，根際微生物區系明顯改善，結果與其防治效果一致，兩種菌的加和處理對尖孢鐮刀菌的抑制效果更好。

菌株Yb1和Yb2不僅具有多種拮抗促生因子，而且在實踐中表現了抗病促生能力，因此菌株Yb1和Yb2具有生防潛力，兩株菌配合應用效果更好。

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