脂氧素A4抑制5-LOX合成對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用

陳 良， 余 鋒， 劉曉敏

腦血管病包括缺血性和出血性腦血管病，其中缺血性腦血管病占80%～85%，缺血性腦血管病以血栓或栓塞引起血管閉塞為特征，大腦中動脈是最常見的梗死發生部位[1]。腦卒中后，炎癥損傷已被公認是主要的損傷機制，閉塞后的再灌注通過增加氧自由基的產生，進一步加劇了神經元的損傷[2]。

白三烯(LTs)是5-脂氧合酶(5-LOX)作用于花生四烯酸(AA)的代謝物，是公認的強效促炎物質[3]。脂氧素(LXs)是內源性“炎癥制動信號”家族中的一員，在炎癥中與白三烯作用相反。脂氧素A4(LXA4)作為最重要的脂氧素之一，與其耦聯的G蛋白稱為脂氧素A4受體(ALXR)。Boc2是ALXR的特異性拮抗劑。側腦室注射LXA4后通過局部過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)介導的腦缺血損傷調節作用機制，目前仍不是很清楚[4]。

已證明抑制星形膠質細胞的炎癥反應可減小腦梗死體積[5]，但很少有研究探討LXA4在神經保護作用中的機制，因此我們模擬了腦缺血/再灌注的大鼠模型(MCAO/R)來闡明LXA4對神經的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物與模型 SPF級10～12 w齡雄性Wistar，體重250～300 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。MCAO建模：水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉后，解剖右側頸總動脈、頸內動脈和頸外動脈，頸總動脈近心端血管夾夾閉短暫阻斷血流，將0.28 mm的MCAO專用線栓通過頸外動脈遠端插至頸內外動脈分叉處，線栓到達大腦中動脈起始段為止，絲線打結固定線栓，2 h后抽回線栓以恢復灌注。假手術組以相同的手術方式操作但不阻斷血流。所有手術操作均在無菌條件下完成，操作前肌注青霉素8萬單位預防感染。整個過程中體溫維持儀監測和保持體溫在37 ℃，激光多普勒血流儀(Periflux System 5000)在造模前后監測局部腦血流量。排除標準：局部腦血流量減少未達70%以上，在實驗過程中死亡和在腦組織提取過程中發現有蛛網膜下腔出血的動物。

隨機法將動物分為4組，每組10只，其中5只用于TTC染色，5只用于WB和ELISA檢測。(1)對照組：假手術大鼠側腦室注射5 μl生理鹽水；(2)MCAO/R組：建模后側腦室注射5 μl生理鹽水；(3)LXA4組：建模后側腦室注射5 μl LXA4(0.2 mmol/L)；(4)LXA4+Boc2組：建模后側腦室注射4 μl LXA4(0.25 mmol/L)和1 μl Boc2(10 mmol/L)。

1.2 方 法

1.2.1 神經功能評估 MCAO/R 24 h后，神經功能評分。0分：沒有神經缺陷；1分：未能充分張開對側前爪；2分：拖尾時對側前肢抓地力下降；3分：自動盤旋或向健側行走；4分：沒有自發的運動活動；5分：對刺激沒有任何反應。

1.2.2 腦含水量測定 使用濕/干方法測定同側(假手術組)或缺血半球的含水量。新鮮大腦半球稱重后置于100 ℃烘箱中烘烤24 h，稱得干重。腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.2.3 腦梗死體積百分比 制備2 mm腦片，腦片于2%的TTC染液中37 ℃避光30 min。染色后拍照，應用Photoshop CS 5.0軟件進行分析。所有腦片的梗死面積之和即為總梗死面積，乘以腦片的厚度即是梗死體積。為了排除腦水腫的影響，計算如下:校正的梗死體積=健側半球體積-(患側半球體積-患側半球梗死體積)，水腫校正后梗死體積百分比(%)=(校正的梗死體積/健側半球體積)×100%。

1.2.4 Western blot RIPA法提取腦總蛋白，BCA法測定蛋白濃度：40 μg蛋白樣品在12%SDS聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，雜交一抗5-LOX (1∶200)；ERK和磷酸化ERK1/2(1∶500)；p38和磷酸化p38(1∶500)；JNK和磷酸化JNK (1∶500)，4 ℃孵育過夜，過夜的纖維素膜徹底漂洗后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)在37 ℃孵育1 h。洗膜后電化學發光液(ECL)曝光顯影，Image J軟件分析目標條帶的光密度值。

1.2.5 ELISA 額頂葉大腦皮質組織，按照組織(mg)：PBS(μl)=1∶10的比例充分勻漿組織至無肉眼可見的組織塊，4 ℃，3000 rpm離心20 min，取上清作為待測樣品。根據大鼠ELISA試劑盒說明書檢測大腦皮質中花生四烯酸代謝產物白三烯LTB4和LTC4的濃度。

2 結 果

2.1 LXA4對神經功能、腦含水量、梗死體積百分比的影響 神經功能評分：假手術組沒有任何缺損，實驗組評分為(2.83±0.41)。LXA4組的評分顯著降低，Boc2拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖1A)。與假手術組相比，MCAO/R組缺血半球腦含水量顯著增加(P<0.05)。LXA4顯著降低了腦含水量(P<0.05)，且可被Boc2阻斷(P<0.05)(見圖1B)。MCAO/R組腦缺血明顯，梗死體積百分比高達(76.4±2.84)，LXA4明顯降低了梗死體積百分比(P<0.05)。LXA4 +Boc2組中梗死體積百分比相對于LXA4組顯著升高(P<0.05)，但仍低于MCAO/R組(P<0.05)(見圖1C、D)。

2.2 LXA4對5-LOX的影響 MCAO/R模型中5-LOX表達水平顯著增加(P<0.05)，其表達可被LXA4抑制(P<0.05)。而且Boc2部分拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖2A、B)。同時，我們還檢測了LTB4和LTC4的表達水平(P<0.05)(見圖2C、D)。

2.3 ERK信號通路 ERK激活體ERK1/2的磷酸化水平在MCAO/R模型顯著增加。LXA4明顯抑制了ERK1/2的磷酸化水平(P<0.05)，Boc2拮抗了LXA4的抑制作用(P<0.05)(見圖3A)。然而JNK和p38的磷酸化水平改變，無統計學意義(圖3B、C)。

與假手術組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組&P<0.05

圖1 LXA4對神經功能、腦含水量、腦梗死體積百分比的影響

與假手術組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組相比&P<0.05

圖2 LXA4對5-LOX及其產物LTB4、LTC4的影響

與假手術組相比*P<0.05；與MCAO組相比#P<0.05；與LXA4組相比&P<0.05

圖3 LXA4對ERK 信號途徑的影響

3 討 論

急性腦缺血和隨后的再灌注引起炎癥級聯反應是腦缺血后損傷的關鍵因素，機制包括細胞內鈣超載、ROS、蛋白水解酶系統的過度活化和促炎細胞因子的釋放[6]。因此，炎癥成為卒中治療的潛在靶點。5-LOX受各種刺激后，易位至核膜，與蛋白FLAP結合成為復合物，該復合物再將AA轉換為LTs[7]。動物和臨床研究均顯示5-LOX和LT參與了腦缺血再灌注損傷，抑制5-LOX后表現出顯著的神經保護作用[8，9]。Ciceri等[10]的研究顯示MK-886(LTs生物合成抑制劑)降低了LTs的表達并減小了大鼠腦梗死體積。但是，Kitagawa等[11]的研究顯示5-LOX基因缺陷小鼠在局灶性腦缺血期間并沒有起到保護作用。該研究中，MCA閉塞后第一天做神經功能評分，但卻在MCA閉塞后的第7天測量梗死體積，兩參數不在同一時間點，所以該實驗的設計存在缺陷。因為在MCA閉塞后幾天內，由于梗死引發的炎癥反應導致了梗死體積的擴大[12]，可能掩蓋了5-LOX的保護作用。5-LOX的保護作用可能只有在病理條件下才變得明顯，而且生理活動要求酶具有基礎的活性，酶的完全失活是有害的，因此采用基因敲除動物進行實驗，結果可能不夠具有代表性[13]。

最近，LXs這一來源于5-LOX的脂質介質也引起了關注。與LXs相關的疾病包括哮喘、內毒素誘導的葡萄膜炎、腎炎、囊性纖維化和各種感染[14]。LXA4的性質包括減少ROS的產生、對鈣通道的影響和減輕急性肺損傷等。Sobrado等[15]首次觀察到外源性LXA4介導PPARγ來保護腦組織免受缺血再灌注損傷，同時作者還發現PPARγ激動劑可以調節5-LOX和LTs的產生，這可能至少部分地解釋了LXA4的神經保護作用。

我們進一步研究LXA4在卒中治療中的潛在作用以及5-LOX/LTs在這種情況下的作用。盡管先前報道LXA4的神經保護作用是由PPARγ介導的，但LXA4的生物學效應主要是通過ALXR介導的。我們將Boc2與LXA4同時給藥，發現LXA4對腦梗死、腦水腫和神經功能缺損的保護作用只是部分通過ALXR介導的，表明LXA4可能是炎癥模型中LTs的負反饋調節因子[16]。因為它的作用并未被Boc2完全阻斷，顯然還有其他受體參與，例如PPARγ[15]。

我們的研究結果顯示腦缺血再灌注誘導ERK磷酸化、5-LOX激活和LTs合成，表明ERK 1/2在缺血再灌注后的腦損傷中發揮著重要作用。但是p38和JNK的磷酸化水平無統計學意義，可能與動物種類、實驗模型、取材位置和研究時間點有關。

綜上所述，我們的研究表明，LXA4可以阻止5-LOX的激活，減少腦缺血再灌注模型誘導的LTs的產生，并且該通路是LXA4在腦缺血再灌注損傷中的神經保護作用的基礎；LXA4能抑制強效促炎介質LTs的產生，LXA4的神經保護作用可能是通過調節炎癥反應實現的，近期曹翔等人[17]的研究表明，LX007可以調節LPS誘導的小膠質細胞內ROS水平，再次證明抗炎應成為腦卒中的治療靶點。

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