肌肽在體外氧化反應(yīng)中的作用

章詩(shī)琪， 夏 莉， 章 秋

肌肽是一種由β-丙氨酸和組氨酸組成的二肽(histidine containing dipeptides, HCD)，是一種水溶性的晶體物質(zhì)。肌肽具有抗氧化、抗糖基化、抗炎、抗增殖等多種生物學(xué)作用[1]。在肌肽的眾多保護(hù)性作用中，抗氧化功能是最早被發(fā)現(xiàn)，也是最為重要的作用。肌肽的保護(hù)性作用多是基于其抗氧化功能。例如，肌肽因其抗氧化作用而對(duì)糖尿病腎病具有一定的改善作用[2]。然而，有研究者發(fā)現(xiàn)肌肽可以增強(qiáng)鐵和碘引起的魯米諾氧化反應(yīng)[3-4]。這種相悖的結(jié)果很可能是由于衡量氧化反應(yīng)的系統(tǒng)不一致導(dǎo)致的。因此，該研究擬分別以辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或FeCl3為氧化劑，在藍(lán)四氮唑比色法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、3,3′-5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5’-tetra-methyl-benzidine，TMB)及魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)中分別評(píng)估肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical cord cells, HUVEC)購(gòu)自德國(guó)Promo Cell公司；內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液購(gòu)自德國(guó)Provitro公司；DMEM/F-12(GlutaMAXGibco?)及小牛血清(fetal calf serum, FCS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；豆蔻酸-12佛波醇-13乙酸酯(PMA)、FeCl3、肌肽、魯米諾及p-香豆酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HRP購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司；TMB購(gòu)自瑞士Roche公司；過(guò)氧化氫購(gòu)自德國(guó)Merck公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Infinite M200)購(gòu)自瑞士TECAN公司。

1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)用HUVEC來(lái)分析肌肽在MTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞的抗氧化作用。接種HUVEC前1 d，細(xì)胞培養(yǎng)板需要用1%明膠覆蓋過(guò)夜，隔日去除明膠，將HUVEC置于含有2% FCS的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液以及5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3中性粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)用中性粒細(xì)胞來(lái)分析肌肽在化學(xué)發(fā)光法中對(duì)細(xì)胞的促氧化作用。中性粒細(xì)胞從健康志愿者的EDTA全血中分離，志愿者均簽署知情同意書。中性粒細(xì)胞具體分離方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]。從全血中提取出的中性粒細(xì)胞由DMEM/F-12稀釋，以每孔105個(gè)細(xì)胞的濃度種植于96孔板。因PMA可以刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS)，故1 μg/ml PMA以及不同濃度的肌肽隨之加入中性粒細(xì)胞中，并在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1 h。不同條件下中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)量。

1.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞在氧化劑FeCl3作用下可能發(fā)生細(xì)胞凋亡[6]，而本實(shí)驗(yàn)則利用MTT實(shí)驗(yàn)衡量細(xì)胞在FeCl3和肌肽作用下的存活率。HUVEC在96孔板中連續(xù)培養(yǎng)2 d后，加入培養(yǎng)液(對(duì)照組)或溶有300 μmol/L FeCl3和(或)20 mmol/L肌肽的培養(yǎng)液(實(shí)驗(yàn)組)中孵育。每孔溶液的總量為100 μl。孵育24 h后于每孔中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)在37 ℃孵育4～5 h。當(dāng)孔板中形成不溶的甲臜后，再加入100 μl以10%濃度溶于10 mmol/L鹽酸的十二烷基硫酸鈉。再次將96孔板孵育過(guò)夜直至甲臜結(jié)晶完全溶解。MTT實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟如本項(xiàng)目另一文獻(xiàn)[6]所述。最終用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值。對(duì)照組中HUVEC的細(xì)胞存活率被認(rèn)定為100%，其余實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率根據(jù)相對(duì)吸光值計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)處理?xiàng)l件均重復(fù)至少6次。

1.5TMB實(shí)驗(yàn)TMB能夠與HRP發(fā)生反應(yīng)形成深藍(lán)色沉淀，從而檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的氧化反應(yīng)。首先，將0.1 μg/ml HRP或300 μmol/L FeCl3作為氧化物，分別與水或20 mmol/L肌肽混勻以100 μl總量加入透明的96孔板，再將200 μl TMB加入溶液用以顯色。最終加入50 μl 1 mmol/L的硫酸終止顯色反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)共分為4組：去離子水對(duì)照組、肌肽對(duì)照組、HRP或 FeCl3組、HRP或FeCl3+肌肽組。顯色反應(yīng)激發(fā)的450 nm波長(zhǎng)的吸收光用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量。

1.6魯米諾反應(yīng)魯米諾能夠與氧化劑反應(yīng)而激發(fā)出藍(lán)光。在細(xì)胞外的魯米諾反應(yīng)中，20 mmol/L肌肽、300 μmol/L FeCl3和0.1 μg/ml HRP以100 μl總量加入白色的96孔板。再加入2.5 mmol/L魯米諾、0.9 mmol/L p-香豆酸以及0.03%過(guò)氧化氫，10 min后再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量化學(xué)發(fā)光。此實(shí)驗(yàn)共分為4組：去離子水對(duì)照組、肌肽對(duì)照組、HRP或 FeCl3組、HRP或FeCl3+肌肽組。另外，本實(shí)驗(yàn)在魯米諾反應(yīng)中加入抗氧化物質(zhì)N-辛酰基多巴胺(N-octanoyl dopamine，NOD)、氯化鋅(ZnCl2)或鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine，DFO)進(jìn)一步證明肌肽在魯米諾反應(yīng)中的氧化作用。

與上述細(xì)胞外的魯米諾反應(yīng)不同，在中性粒細(xì)胞中發(fā)生的魯米諾反應(yīng)則僅用魯米諾及p-香豆酸顯色，而不加入外源性過(guò)氧化氫。魯米諾反應(yīng)所需的過(guò)氧化氫是由PMA刺激中性粒細(xì)胞去顆粒化產(chǎn)生的。

2 結(jié)果

2.1MTT實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用MTT實(shí)驗(yàn)假定對(duì)照組中的HUVEC細(xì)胞存活率為100%，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示僅加入肌肽對(duì)HUVEC細(xì)胞存活沒(méi)有影響，但300 μmol/L FeCl3使HUVEC的細(xì)胞存活率顯著下降至(11.06±3.84)%(P<0.05)。而20 mmol/L肌肽能夠阻止FeCl3對(duì)HUVEC的影響，此組細(xì)胞的存活率再次上升至(158.79±3.91)%(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肌肽及FeCl3對(duì)HUVEC的影響

1：對(duì)照組；2：20 mmol/L 肌肽；3：300 μmol/L FeCl3；4：20 mmol/L 肌肽+300 μmol/L FeCl3；與300 μmol/L FeCl3組比較：*P<0.05

2.2TMB實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用在細(xì)胞外的TMB實(shí)驗(yàn)中，肌肽本身不能激發(fā)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生光密度(P>0.05)，見(jiàn)圖2A。氧化劑HRP(圖2A)和FeCl3(圖2B)均能增強(qiáng)光密度(P<0.05)，且HRP的氧化能力明顯大于FeCl3(P<0.05)。另外，肌肽并不影響HRP和FeCl3導(dǎo)致的氧化反應(yīng)(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 TMB實(shí)驗(yàn)觀察肌肽對(duì)HRP或FeCl3導(dǎo)致的氧化反應(yīng)的影響

A：HRP；B：FeCl3；1：對(duì)照組；2: 20 mmol/L 肌肽；3: 0.1 μg/ml HRP；4: 0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽；5：300 μmol/L FeCl3；6：300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L 肌肽；與對(duì)照組比較：*P<0.05

2.3魯米諾實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用在細(xì)胞外的魯米諾實(shí)驗(yàn)中，肌肽本身可以不依賴任何氧化劑的催化而顯著增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(P<0.05)，然而，肌肽對(duì)魯米諾實(shí)驗(yàn)的氧化作用要遠(yuǎn)低于HRP的作用(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。但是如果在肌肽參與的反應(yīng)中加入HRP，化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)單獨(dú)使用肌肽或HRP(P<0.05)，見(jiàn)圖3A。本實(shí)驗(yàn)中FeCl3并未能氧化并催化魯米諾反應(yīng)，只有加入肌肽才能顯著性提高其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(P<0.05)，見(jiàn)圖3B。

另外，HRP或FeCl3催化的反應(yīng)中，抗氧化物質(zhì)N-辛酰基多巴胺(N-octanoyl dopamine，NOD)、氯化鋅(ZnCl2)或鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine，DFO)均能減弱肌肽激發(fā)的魯米諾發(fā)光強(qiáng)度(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖3 肌肽對(duì)HRP或FeCl3催化的魯米諾反應(yīng)的影響

A：HRP；B：FeCl3；1：對(duì)照組；2: 20 mmol/L 肌肽；3: 0.1 μg/ml HRP；4: 0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽；5：300 μmol/L FeCl3；6：300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L 肌肽；與對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與2組比較：▲P<0.05；與5組比較：#P<0.05

2.4PMA激活的中性粒細(xì)胞中肌肽對(duì)氧化作用的影響在中性粒細(xì)胞中，濃度小于5 mmol/L的肌肽在30 min內(nèi)不能刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，從而激發(fā)魯米諾反應(yīng)。由圖5可知，0、1.25、2.5、5 mmol/L肌肽的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均表現(xiàn)為低平曲線。而濃度大于10 mmol/L的肌肽，自15 min起可明顯增強(qiáng)中性粒細(xì)胞內(nèi)的魯米諾反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)大于2倍，而且這種增強(qiáng)與肌肽的劑量相關(guān)。

3 討論

雖然大多數(shù)研究表明肌肽是一種抗氧化物質(zhì)，但仍有少部分研究質(zhì)疑此結(jié)論。尤其是在體外實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，多個(gè)研究[3,7]顯示肌肽有促氧化作用。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，肌肽則一直表現(xiàn)出抗氧化的特性[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肌肽在MTT實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗氧化特性，在TMB實(shí)驗(yàn)為中性物質(zhì)，而在魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)中則表現(xiàn)出促氧化的性質(zhì)。因此，肌肽的抗氧化性質(zhì)很可能在不同的反應(yīng)系統(tǒng)中存在差異。

圖4 NOD、ZnCl2和DFO對(duì)肌肽激發(fā)的、HRP和

A：HRP；B：FeCl3；1：0.1 μg/ml HRP；2：0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽；3：0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+100 μmol/L NOD；4：0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+10 mmol/L ZnCl2；5：0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+1.6 mmol/L DFO；6: 300 μmol/L FeCl3；7：300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽；8：300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽+100 μmol/L NOD；9：300 μmol/L FeCl3+ 20 mmol/L肌肽+10 mmol/L ZnCl2；10：300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽+1.6 mmol/L DFO；與0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽組比較：*P<0.05；與300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽組比較：▲P<0.05

圖5 肌肽對(duì)PMA激發(fā)的中性粒細(xì)胞中氧化反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

本研究顯示肌肽能夠拮抗FeCl3對(duì)HUVEC的氧化毒性，與相關(guān)文獻(xiàn)[6]相似。一方面可能由于鐵離子可以和肌肽形成螯合物，使其不能進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用；另一方面肌肽能夠下調(diào)HUVEC中鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體(二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)，使鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的量減少[6]。 另外，Reddy et al[8]發(fā)現(xiàn)肌肽的咪唑環(huán)可以和ROS或羥自由基中激活的電子形成共價(jià)鍵，形成穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，從而達(dá)到拮抗后兩者氧化的作用。

Achyuthan et al[3]研究顯示肌肽的抗氧化或促氧化作用事實(shí)上取決于肌肽的生產(chǎn)商。商業(yè)制劑中污染物肼的濃度決定了肌肽的性質(zhì)[14]。本實(shí)驗(yàn)使用的肌肽由Sigma公司生產(chǎn)。與Fluka或Research Organics公司生產(chǎn)的肌肽相比，Sigma公司生產(chǎn)的肌肽抗氧化活性最低。Achyuthan et al[3]研究還表明肌肽的作用受氧化劑的影響。如果化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的氧化劑由較高濃度的H2O2和較低濃度的鐵組成，肌肽表現(xiàn)為抗氧化作用；如果氧化劑由較高濃度的鐵組成，肌肽則表現(xiàn)為促氧化作用。本實(shí)驗(yàn)的魯米諾反應(yīng)使用的鐵的濃度為肌肽濃度的3倍以上，這可能也是其表現(xiàn)為促氧化作用的原因。

本研究結(jié)果顯示肌肽甚至可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)。然而，Sharonov et al[15]使用了與本研究相同的實(shí)驗(yàn)條件，卻得出完全相反的結(jié)論：肌肽可以抑制由PMA激發(fā)的中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)。但此二者結(jié)論矛盾的具體原因仍不明，有待于進(jìn)一步研究。

盡管有不同的研究反復(fù)論證肌肽的抗氧化或促氧化性質(zhì)，但到目前為止，還沒(méi)有研究表明肌肽是中性物質(zhì)，亦沒(méi)有研究使用TMB系統(tǒng)測(cè)定肌肽的氧化作用。本實(shí)驗(yàn)中肌肽在TMB系統(tǒng)中既無(wú)抗氧化，也無(wú)促氧化作用。這可能是由于肌肽的作用被實(shí)驗(yàn)中的終止液H2SO4中和。TMB實(shí)驗(yàn)中H2SO4(1 mmol/L)的濃度高于p-香豆酸(0.9 mmol/L)，而在這種情況下，肌肽不能形成肌肽-自由基加合物而促進(jìn)化學(xué)發(fā)光。迄今，F(xiàn)enton反應(yīng)不能在TMB系統(tǒng)中被激活的原因仍未知，有待于進(jìn)一步研究。

事實(shí)上，肌肽被普遍定義為抗氧化劑，但它偶爾表現(xiàn)的促氧化作用一方面可能與溶劑的pH值有關(guān)，另一方面與其作用的底物有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為肌肽在未來(lái)的臨床應(yīng)用中提出相關(guān)注意事項(xiàng)及用藥禁忌。

[1] Boldyrev A A, Aldini G, Derave W. Physiology and pathophysiology of carnosine[J]. Physiol Rev, 2013, 93(4): 1803-45.

[2] Janssen B, Hohenadel D, Brinkkoetter P, et al. Carnosine as a protective factor in diabetic nephropathy: association with a leucine repeat of the carnosinase gene CNDP1[J]. Diabetes, 2005, 54(8): 2320-7.

[3] Achyuthan K E. Enhancement of aminophthalhydrazides chemiluminescence by N-beta-alanyl-L-histidine (L-carnosine)[J]. Luminescence, 1999, 14(2): 75-81.

[4] Shi X, Dalal N, Kasprzak K S. Enhanced generation of hydroxyl radical and sulfur trioxide anion radical from oxidation of sodium sulfite, nickel(II) sulfite, and nickel subsulfide in the presence of nickel(II) complexes[J]. Environ Health Perspect, 1994, 102(Suppl 3): 91-6.

[5] Al Laham F, K?lsch A I, Heinrich L, et al. Inhibition of neutrophil-mediated production of reactive oxygen species (ROS) by endothelial cells is not impaired in anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (ANCA)-associated vasculitis patients[J]. Clin Exp Immunol, 2011, 161(2): 268-75.

[6] Zhang S, Ntasis E, Kabtni S, et al. Hyperglycemia does not affect iron mediated toxicity of cultured endothelial and renal tubular epithelial cells: influence of L-carnosine[J]. J Diabetes Res, 2016, 2016: 8710432.

[7] Mozdzan M, Szemraj J, Rysz J, et al. Antioxidant properties of carnosine re-evaluated with oxidizing systems involving iron and copper ions[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2005, 96(5): 352-60.

[8] Reddy V P, Garrett M R, Perry G, et al. Carnosine: a versatile antioxidant and antiglycating agent[J]. Sci Aging Knowledge Environ, 2005, 2005(18): pe12.

[9] Chen S, Yan G, Schwartz M A, et al. Penicillin-enhanced chemiluminescence of the luminol-H2O2-Co2+ system[J]. J Pharm Sci, 1991, 80(11): 1017-9.

[10] Li N, Ni S. Amino acids as novel nucleophiles for silver nanoparticle-luminol chemiluminescence[J]. Luminescence, 2014，29(8):1130-4.

[11] Wen C C, Wang C T, Chou W L, et al. Degradation of DMSO in aqueous solutions by the Fenton reaction based advanced oxidation processes[J]. Fresenius Environmental Bulletin, 2012, 21(3): 644-50.

[12] Elias R J, Waterhouse A L. Controlling the fenton reaction in wine[J]. J Agric Food Chem, 2010, 58(3): 1699-707.

[13] Aristova N A, Ivanova I P, Trofimova S V, et al. Influence of luminol on the chemiluminescence intensity in Fenton's reaction[J]. High Energy Chem, 2011, 45(6): 505-9.

[14] Zhou S, Dickinson L C, Yang L, et al. Identification of hydrazine in commercial preparations of carnosine and its influence on carnosine's antioxidative properties[J]. Anal Biochem, 1998, 261(1): 79-86.

[15] Sharonov B P, Govorova N J, Lyzlova S N. Carnosine as a potential scavenger of oxidants generated by stimulated neutrophils[J]. Biochem Int, 1990, 21(1): 61-8.