999感冒靈顆粒抗呼吸道合胞病毒的初步研究

孫 濤，程茂勝，袁曉玲，張曉燕，黃升海

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)屬于副黏病毒科肺炎病毒屬，是一種有包膜非節段的單股負鏈RNA病毒，主要有3種包膜糖蛋白(F、G、SH)，其中G蛋白為吸附蛋白，可以與細胞表面的特異性受體結合，F蛋白為融合蛋白，感染細胞后會引起細胞融合病變，RSV感染主要是由這兩種蛋白引起的。有研究[1-4]表明，呼吸道合胞病毒是世界范圍內嬰幼兒下呼吸道感染最常見的病毒病原體。70%的1歲兒童感染過RSV，2歲兒童幾乎均被RSV感染過，早產兒及其患有先天性心臟病的兒童更容易引起RSV相關的下呼吸道感染，特別是支氣管炎和細支氣管炎，是1歲以下兒童住院的最主要原因[5]。此外研究[5-6]表明，嬰幼兒感染RSV后不僅可以導致急性疾病，還可導致長期的不良后果，如誘發氣道高反應性、誘發哮喘兒童出現反復的喘鳴等，導致病毒血癥，嚴重者會發生心力衰竭導致死亡。RSV感染的病理機制尚不明確，目前為止仍無有效的藥物和疫苗接種，曾有以福爾馬林滅活的RSV作為疫苗預防接種嬰幼兒，發現自然感染RSV后與其未接種疫苗的感染者相比會出現更為嚴重的支氣管痙攣性肺炎，并會造成死亡。臨床上治療RSV感染多采用抗病毒和抗炎聯合治療[7]。

999感冒靈顆粒主要成分為三叉苦、金盞銀盤、野菊花、崗梅、咖啡因、對乙酰氨基酚、馬來酸氯、苯那敏、薄荷油，輔料為蔗糖粉。主要功能是解熱鎮痛，用于感冒引起的頭痛、發熱、鼻塞、流涕、咽痛等。目前已有文獻[8-10]報道，野菊花和薄荷油均具有抗呼吸道合胞病毒的功效，而999感冒靈作為一種感冒藥對呼吸道合胞病毒的抗性作用卻未見文獻報道。因此開展對999感冒靈顆粒的抗病毒研究，可為臨床有效地預防和治療RSV疾病提供一定的幫助。

1 材料與方法

1.1細胞及病毒HEp-2細胞(人喉癌上皮細胞)，呼吸道合胞病毒為國際標準Long株，以上均由安徽醫科大學微生物學教研室保存。

1.2主要試劑新生牛血清(杭州四季青公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；Hyclone胰酶(北京利維寧生物科技有限公司)；CCK-8試劑盒(500T；海門碧云天生物技術研所)；利巴韋林注射液(1 ml ∶0.1 g；濟寧辰欣藥業股份有限公司)；999感冒靈顆粒(每袋重10 g；華潤三九醫藥股份有限公司)；各種規格的培養板(美國Falcon公司)。

1.3細胞培養細胞的復蘇：從液氮罐中取出細胞凍存管，立刻放入37 ℃水中進行水浴，使其在1 min內融化。然后將凍存管中的細胞接種到細胞培養皿中加細胞培養液置37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。8 h后更換細胞培養液繼續培養。傳代：打開已經長成單層細胞的培養皿，用移液槍將廢液棄去；然后再用移液槍吸取1～2 ml滅菌的PBS清洗細胞表面的死細胞以及殘留血清，一般清洗2～3次；向培養皿中加入0.25%的胰酶1 ml進行消化，在倒置顯微鏡下觀察，待細胞變圓、細胞間質變大，立刻終止消化。加入4 ml細胞培養液，用移液器反復吹打細胞成為細胞懸液。將細胞懸液轉移到離心管中4 ℃、1 000 r/min離心5 min。輕輕吸取上清后用細胞培養液重懸細胞，把細胞一分為二轉移到新的培養皿中。將接種好的細胞置37 ℃、5% CO2培養箱進行培養。

1.4實驗分組、病毒復蘇與病毒感染量的測定實驗分組為:① 直接滅活組；② 抑制吸附組；③ 抑制增殖組；④ 阻斷作用組。病毒的復蘇：從-80 ℃冰箱取出病毒管，用細水流沖洗管壁，使其緩慢融化。4 ℃、1 000 r/min離心5 min，將病毒上清液接種至已長成單層的HEp-2細胞培養皿中進行增殖，然后放在37 ℃、5% CO2培養箱中吸附2 h。之后加入細胞維持液再進行培養，觀察細胞生長情況以及病變效應(cytopathic effect，CPE)?！?”為無細胞病變，細胞病變<25%為“+”，細胞病變25%～50%為“”，細胞病變50%～75%為“”，細胞病變>75%為“”。等細胞病變效應達到“”時，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液分裝后放入-80 ℃冰箱備用。病毒滴度測定：將增殖后的病毒用維持液進行10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12、10-13不同濃度梯度稀釋，依次接種于已長成單層的96孔HEp-2細胞培養板孔中，每孔0.1 ml。37 ℃吸附2 h后，棄上清液，加維持液后放在37 ℃、5 % CO2的恒溫培養箱中培養，24 h后觀察細胞病變，按Reed-Muench法計算病毒的半數感染量(tissue culture infective dose，TCID50)。

1.5999感冒靈顆粒的毒性測定將999感冒靈顆粒用含DMEM培養液稀釋成400 mg/ml,再用含3%血清的培養液進行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀釋，將稀釋后的藥液加到已長成單層的HEp-2細胞96孔培養板中，每孔100 μl，每個濃度梯度做4個復孔，同時設正常HEp-2 細胞作為空白對照組。重復3次試驗。然后將96孔板放在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中培養3 d，并且每天觀察細胞病變。3 d后計算細胞不出現病變(999感冒靈顆粒對HEp-2細胞的毒性作用)的最高稀釋倍數，即為其最大無毒濃度(maximum non-toxic concentration，TC0)，即對HEp-2細胞的最大無毒濃度，再按Reed-muench 法計算其50%毒性濃度(median toxic concentration，TC50)。

1.6陽性對照利巴韋林注射液的細胞毒性測定將利巴韋林注射劑用含DMEM培養液初步稀釋，再用含3%血清的培養液進行1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024倍比稀釋，將稀釋后的藥液加到已長成單層的HEp-2細胞96孔培養板中，每孔100 μl，每個濃度梯度做4個復孔，同時設正常HEp-2 細胞作為空白對照組。重復3次試驗。然后將96孔板放在37 ℃、5 % CO2恒溫培養箱中培養3 d，并且每天觀察細胞病變。3 d后計算細胞不出現病變(利巴韋林注射液對HEp-2細胞的毒性作用)的最高稀釋倍數，即為其TC0，即對HEp-2細胞的最大無毒濃度，再按Reed-muench 法計算其TC50。

1.7對病毒復制增殖的抑制作用將已長成單層的HEp-2 細胞96孔培養板吸棄培養液，用PBS 洗3次，加入100 TCID50的RSV病毒液，100 μl/孔，置37 ℃、5% CO2培養箱中吸附2 h，使病毒進入細胞；棄去多余病毒液，用PBS洗2次，洗去游離的病毒，再加入999感冒靈顆粒溶液從TC0濃度開始作連續2 倍系列稀釋的6個濃度稀釋液(維持液稀釋)，100 μl/孔，每個濃度均重復4個復孔，同時設正常細胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。重復3次試驗。當病毒對照組病變達到75%以上時，每孔加入10 μl的CCK-8試劑，培養4 h以后測定波長在450 nm的吸光度(absorbance，A)值。計算藥物的抑制百分率，評價抗病毒效果。根據各組之平均吸光度值，計算抑制百分率，再按Reed-Muench法計算藥物半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，求出治療指數(therapeutic index，TI)。

抑制百分率(%)=(實驗組平均A值-病毒對照組平均A值)/(細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值)×100%，記錄實驗結果。TI=TC50/IC50進行計算。

1.8對病毒的直接滅活以TC0濃度開始作連續2倍系列稀釋的8個濃度稀釋液(維持液稀釋)，分別與100 TCID50的RSV病毒液等量混合，37 ℃作用2 h，然后接種到已長成單層的HEp-2細胞96孔培養板中，放在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時設正常細胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。

1.9抑制病毒的吸附以TC0濃度開始作連續2倍系列稀釋的8個濃度稀釋液(維持液稀釋)，分別與100 TCID50的RSV病毒液等量混合，直接接種到已長成單層的HEp-2細胞96孔培養板中，放在37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時設正常細胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。

1.10對病毒的阻斷作用以TC0濃度開始作連續2倍系列稀釋的8個濃度稀釋液(維持液稀釋)，加入到已長成單層的HEp-2 細胞96孔培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養2 h，用PBS洗2次，然后加入100 TCID50的RSV病毒液，置37 ℃、5% CO2培養箱中吸附2 h，棄上清液，加維持液200 μl。同時設正常細胞對照組和病毒對照組以及陽性對照組(陽性對照組濃度為利巴韋林最大無毒劑量)。其余同1.6。以上每組實驗均設立4 ～ 8個復孔進行。

1.11統計學處理采用SPSS 17.0軟件進行分析，多樣本均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨立樣本t檢驗統計學分析，Reed - Muench法計算藥物TC50和IC50及TI，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1RSV病毒半數感染量的滴定病毒TCID50的滴定結果為：1×10-6.23/0.1 ml。

2.2999感冒靈顆粒的細胞毒性測定按Reed-muench 法計算，可得知TC50=2-4；TC0=2-5。因為999感冒靈顆粒原液濃度為400 mg/ml，所以TC50=25 mg/ml；TC0=12.5 mg/ml。利巴韋林的細胞毒性測定TC50=93.1 mg/ml，TC0=5.0 mg/ml。

2.3999感冒靈顆粒在HEp-2細胞的抗呼吸道合胞病毒實驗

2.3.1對病毒復制增殖的抑制作用 RSV感染HEp-2細胞出現CPE的特征主要為細胞圓縮、腫脹以及細胞之間的融合。在藥物的TC0的范圍內，藥物濃度的越高，細胞出現CPE的程度會越低。病毒的抑制百分率與藥物的濃度具有量效關系且與病毒對照組比較差異有統計學意義(t=8.56、17.71、6.98、7.99、5.51、13.21，P<0.01)，見表1。其對呼吸道合胞病毒的IC50為4.42 mg/ml,TI為5.66；利巴韋林陽性對照組IC50為1.30 mg/ml，TI為71.6(F=54.44，P<0.01)，見圖1。說明999感冒靈顆粒對RSV的復制增殖有抑制作用。

2.3.2對病毒的直接滅活 實驗結果表明，999感冒靈對病毒有直接滅活的作用，主要表現在隨著藥物濃度的增加，細胞的CPE特征隨之降低，細胞的存活率也隨之上升且與病毒對照組比較差異有統計學意義(t=16.32、8.63、5.56、6.71、13.1、9.33，P<0.01)，見表1。其對呼吸道合胞病毒的IC50為7.43 mg/ml,TI為3.36；利巴韋林陽性對照組IC50為1.12 mg/ml，TI為83.1(F=7.51，P<0.05)。見圖2。

2.3.3抑制病毒的吸附 結果可見，在TC0以下的不同濃度實驗組中細胞均出現腫脹、圓縮以及細胞融合等典型的CPE癥狀。細胞的抑制百分率與細胞對照組比較差異無統計學意義(t=1.31，P>0.05)，利巴韋林陽性對照組IC50為1.53 mg/ml，TI為60.1(F=239.46，P<0.01)，見表1。所以999感冒靈顆粒并沒有抑制病毒吸附的作用。

2.3.4對病毒的阻斷作用 實驗結果表明，999感冒靈顆粒對病毒并無阻斷作用，對呼吸道合胞病毒的感染無預防作用。具體表現在不同藥物濃度下細胞均出現典型的CPE癥狀，CCK-8結果顯示細胞的抑制百分率與病毒對照組比較差異無統計學意義(t=1.12，P>0.05)，利巴韋林陽性對照組IC50為1.44 mg/ml，TI為64.7(F=103.23，P<0.01)，見表1。

圖1 CCK-8法測定不同濃度藥物抑制病毒增殖作用

圖2 CCK-8法測定不同濃度藥物直接滅活病毒結果

組別濃度(mg/ml)CPE細胞對照-病毒對照 陽性對照+實驗組 抑制增殖12.50+??##6.250 ??##3.125 ??##1.563 ?##0.782 ??##0.391 ?## 直接滅活12.50 ?##6.250 ?##3.125 ?##1.563 ?##0.782 ?##0.391 ?## 抑制吸附12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391 阻斷作用12.50 6.250 3.125 1.563 0.782 0.391

與陽性對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與病毒對照組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

在臨床疾病譜中，由病毒引起的感染性疾病比例高達75%以上，一直威脅人類的生命與健康，其中最常見的是呼吸道合胞病毒引起的感染[11]。但目前并沒有行之有效的抗RSV治療手段，唯一用于治療的是廣譜抗病毒藥物利巴韋林，由于其具有很強的毒副作用，所以僅限于病情嚴重和高?；純?，在臨床實踐運用中效果并不理想。人類單克隆抗體-palivizumab(Synagis)和靜脈用免疫球蛋白己經注冊使用，療效較好，但是其一個周期治療所需費用很高，不能普遍應用于臨床。因此，尋找有效廉價的防治RSV感染的藥物意義非凡。

國內已有相關文獻[12]報道證實，野菊花、薄荷油等天然藥物成分具有一定的抗RSV和其他種類病毒的作用與功效。而本實驗所使用的999感冒靈作為一種常見的感冒藥其主要有效成分為野菊花、薄荷油，但其對RSV的抗性作用卻未見文獻報道。因此開展對999感冒靈顆粒的抗病毒研究，為其可能的預防RSV感染提供了一定的依據。本文設計了一系列實驗，運用細胞培養技術對999感冒靈顆粒抗RSV作用進行了體外研究。實驗結果表明，999感冒靈顆粒對RSV也有明顯抑制作用。這將可能為開發高效、特異的防治RSV感染的藥物奠定實驗基礎，并為臨床處方的配伍提供線索。同時國外文獻[12-13]也有相關的報道，野菊花對流行性感冒病毒、乙型肝炎病毒等有一定殺滅作用，其也被應用對治療各種瘟疫、癰腫病證，療效確切，也能與其他西藥抗生素藥物結合使用。近年來，國內外學者運用現代理論知識進行了全面分析和研究，作了大量的藥理臨床工作，從科學的角度證實了野菊花具有抗病毒、廣譜抗菌、抗腫瘤等多種藥理作用[14]。

熊建文 等[15]研究表明，CCK-8法檢測細胞活性，最佳的檢測時間是在加入CCK-8試劑細胞培養4 h后，最佳檢測波長為450 nm。與傳統的MTT比色法檢測細胞活性相比，CCK-8法具有操作更加簡便，結果更加準確可反復進行測量等多個優點。傳統的MTT比色法在檢測細胞活性時，需要加入裂解液(如DMSO)溶解沉積在細胞中的甲臜晶體，在此過程中可能會出現晶體顆粒不完全溶解以及在吸取上清夜過程中容易吸走部分細胞，而且加入的裂解液對A值也有一定的影響，所以在吸光度測定時誤差很大，重復性欠佳。而CCK-8法中出現的甲臜晶體是水溶性的，并不需要加入裂解液，也不用吸取上清液，不會造成細胞的流失。而且可以進行反復測量，重復性好，數據穩定，科學性強。所以本實驗采用CCK-8法測定細胞的吸光度值。

本文初步研究了999感冒靈顆?？筊SV的作用效果，TC50為25 mg/ml，最大無毒濃度TC0為12.5 mg/ml。CCK-8結果表明999感冒靈顆粒對RSV有直接滅活的作用，并且隨著藥物濃度的升高，滅活的效果也增強。說明999感冒靈顆粒可能對RSV有直接殺滅的作用，或者有可能藥物中的某種化合物與病毒的某一特異性受體結合，從而使病毒直接滅活，并與陽性對照組作用效果相似。同樣地，999感冒靈顆粒對抑制病毒在細胞中的復制增殖有顯著效果，并在12.5 mg/ml濃度下與陽性對照組相比有著相似作用效果，其作用機制可能是藥物進入細胞抑制了相關蛋白的生物合成或者抑制了核酸的復制。但999感冒靈顆粒對病毒的進入并無阻斷作用，也沒有抑制病毒吸附的作用。說明999感冒靈顆粒并不能阻止病毒侵入細胞與吸附細胞表面，所以并沒有預防的作用。本實驗證實999感冒靈顆粒體外具有抗RSV感染的作用，而且安全性亦較高。但具體是什么成分具有抗病毒作用還需進一步探究。后期也將采用動物模型對999感冒靈的抗病毒作用以及作用機制進行進一步的研究。

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