銅綠假單胞菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測

張 凡,郭 普,張倫軍 ,鄭 晶,鄭照軍,徐元宏

銅綠假單胞菌是一種醫院感染常見的條件致病菌。2015年全國細菌耐藥監測網(china antimicrobial resistance surveillance system，CARSS)監測報告顯示：臨床分離菌中銅綠假單胞菌在革蘭陰性桿菌排第三位,在非發酵菌中位居第一[1]。氨基糖苷類抗生素常作為治療革蘭陰性桿菌及其耐藥菌感染重要的治療藥物[2]。但隨著該類藥物在臨床的應用,銅綠假單胞菌對其耐藥性有所上升[3],其耐藥機制中AMEs和16S rRNA甲基化酶是介導氨基糖苷類抗生素高度耐藥的主要原因[4]。為探討銅綠假單胞氨基糖苷類抗生素耐藥機制以及是否存在16 S rRNA甲基化酶基因，該研究收集分離的對氨基糖苷類抗生素耐藥的菌株，檢測分析5個16S rRNA甲基化酶基因和16個AMEs基因，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1受試菌株收集2016年1～12月蚌埠醫學院第一附屬醫院臨床分離的銅綠假單胞菌248株，選取其中54株氨基糖類抗生素耐藥菌株(剔除重復菌株)。

1.2主要儀器及試劑VITEK-2compact全自動細菌鑒定藥敏儀及配套鑒定藥敏卡(法國梅里埃公司)；PCR擴增儀(法國 BIOER公司)；電泳儀及凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)；藥敏紙片及MH瓊脂(英國OXOID公司)。

1.3菌株鑒定和藥敏試驗用VITEK 2 COMPECT全自動鑒定藥敏分析儀及其配套的鑒定藥敏卡對菌株進行鑒定和藥敏實驗，同時用K-B法復核藥敏結果，根據2016版CLSI標準判讀藥敏結果。

1.4耐藥基因PCR擴增和序列分析

1.4.1PCR引物 21種引物設計根據GenBank收錄的AMEs基因和甲基化酶基因序列，參照文獻[5]，由上海生物工程服務有限公司合成，見表1。

1.4.2氨基糖苷類耐藥基因的檢測 PCR反應體系和擴增參數為：50 μl反應體系:上下游引物各1 μl，Ex Taq酶0.5 μl、10×Buffer 5 μl、dNTP 4 μl、模板DNA 2 μl、 dd H2O 36.5 μl。PCR擴增參數為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸40 s ，30～45個循環；72 ℃保溫 10 min。將所得PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析：Gelred染色劑，1%～1.5%瓊脂糖凝膠，電壓102 V，時間30～40 min。紫外凝膠成像系統觀察結果。陰性對照為重蒸餾水，陽性對照菌株由安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科惠贈。然后將陽性基因擴增產物送至上海生物工程服務有限公司測序，測序結果進行Blast比對。

1.5質控菌株大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853購自國家衛生和計劃生育委員會臨檢中心。

表1 各耐藥基因PCR引物序列、產物長度和退火溫度

表2 54株銅綠假單胞菌氨基糖苷類抗生素耐藥基因陽性率

2 結果

2.1氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測結果54例耐藥菌株共檢出陽性耐藥基因的有52例，檢出率為96.3%(52/54)，存在兩種以上耐藥基因的共45株，檢出率為79.6%(43/54)。3種以上陽性的有27例，檢出率為50.0%(27/54)。21個基因中，共有7種氨基糖苷類抗生素耐藥基因檢測陽性：ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱc、ant(4′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb和ant(2″)-Ⅰa，rmtB，armA。AMEs基因陽性的有51株，檢出率為94.4%。包括5種AMEs基因，其檢出率分別為ant(3″)-Ⅰ36株(66.7% )，aac(3)-Ⅱc 21株(38.9%)，ant(4′)-Ⅰa 17株(31.5%)，aac(6′)-Ⅰb17株(31.5%)，ant(2″)-Ⅰa 9株16.6%；甲基化酶基因陽性的有28株，檢出率為51.9%，包括rmtB 16株(29.6%)和armA16株(29.6%)。其余基因均未檢出。見表2。部分菌株PCR擴增結果見圖1。

2.2氨基糖苷類耐藥基因序列分析結果所得陽性擴增產物測序結果測序結果與目的基因一致，經 BLAST 比對分析，與目的基因相同。部分測序峰圖見圖 2～3。

3 討論

銅綠假單胞菌是引起醫院感染的重要病原菌之一。國內外研究顯示[1,6-8]：該菌是引起醫院感染的第三或四位病原菌，在非發酵菌中位居第一。氨基糖苷類抗菌藥物(aminoglycosides)包括由鏈霉菌或小單胞菌天然產生的鏈霉素、新霉素、慶大霉素等和人工半合成的阿米卡星、丁胺卡拉霉素等。氨基糖苷類抗菌30S 核糖體亞單位的 16S rRNA 解碼區的A部位來抑制細菌蛋白質的合成。2015版抗菌藥物臨床應用指導原則[2]指出，氨基糖苷類藥物對于腸桿菌細菌和銅綠假單胞菌等革蘭陰性桿菌具有強大的抗菌活性。氨基糖苷類藥物作為一線和聯合用藥被廣泛用于敗血癥、肺炎和腦膜炎等由耐藥菌所致的嚴重感染的治療[9]。然而近年來，氨基糖苷類抗生素對銅綠假單胞菌耐藥率也有所上升[10]。產生多重耐藥菌株甚至泛耐藥銅綠假單胞菌，導致臨床用藥及抗感染治療非常困難。

圖1 armA(A)和rmtB(B)基因型PCR擴增結果

圖2 rmtB部分測序峰圖

圖3 aac(3)-Ⅱc部分測序峰圖

銅綠假單胞菌對氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥機制[11-13]有氨基糖苷修飾酶鈍化作用、外膜通透降低、外排泵高表達、靶位突變或甲基化修飾和核開關調控等，其中最主要的是鈍化作用。本研究共檢出7種氨基糖苷類抗生素耐藥基因：ant(3″)-Ⅰ、aac(3)-Ⅱc、ant(4′)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb和ant(2″)-Ⅰa，rmtB，armA 。包括5種AMEs基因和2種16S rRNA甲基化酶基因。AMEs基因陽性的有51株，檢出率為94.4%。5種AMEs基因，其檢出率分別為ant(3″)-Ⅰ 36株(66.7%)，aac(3)-Ⅱc 21株(38.9%)，ant(4′)-Ⅰa 17株(31.5%)，aac(6′)-Ⅰb17株(31.5%)，ant(2″)-Ⅰa 9株16.6%。明德松 等[14]對我國銅綠假單胞菌耐氨基糖苷類基因分布的文獻研究顯示我國不同地域AMEs基因有差別。淮河以北地區 AMEs 基因aac(3′)-Ⅰ、aac(3′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅰ、ant(2″)-Ⅰ的檢出率普遍高于淮河以南地區。AMEs 基因淮河以北主要為ant(2″)-Ⅰ、aac(3′)-Ⅱ、aac(6′)-Ⅱ，淮河以南主要是aac(6′)-Ⅱ、ant(2″)-Ⅰ、aac(3″)-Ⅰ。本次研究顯示的陽性基因與上文研究結果不完全相同，我院地處江淮之間，出現未提及基因ant(4′)-Ⅰa，檢出17株，檢出率31.5%，進一步證實了銅綠假單胞菌多為多重耐藥菌株且易變異的特點。這可能由于不同地區不同抗生素的運用而導致細菌產生不同的耐藥性。本次研究AMEs陽性基因檢出率高達94.4%，并大量出現一株細菌產生多種耐藥基因的情況，說明氨基糖苷類抗生素的大量應用使銅綠假單胞菌產生的多種鈍化酶，其多重耐藥性與之有密切關系。

近年來研究[4,15]表明由質粒介導的16S rRNA甲基化酶基因，能產生對多種氨基糖苷類抗生素高水平耐藥菌株。2003年日本學者首次報道：細菌一旦獲得16S rRNA甲基化酶基因，將對所有氨基糖苷類抗生素的耐藥[4]。該基因的出現對氨基糖苷類抗生素的應用產生了嚴重的影響[16]。本研究中54株銅綠假單胞菌中甲基化酶基因陽性的有28株，51.9%，包括rmtB 16株(29.6%)和armA 16株(29.6%)。說明我院編碼16S rRNA甲基化酶的基因主要是rmtB、armA，與我國報道的甲基化酶主要基因相同[14,17-18]。本次16S rRNA甲基化酶高陽性檢出率顯示：該基因是引起本地銅綠假單菌對氨基糖苷類藥物耐藥的重要原因之一，該耐藥基因的出現說明合理使用氨基糖苷類抗生素亟待重視。另外54株耐藥菌株中還有4株檢測到同時攜帶rmtB 和armA基因，27株檢測到除攜帶16S rRNA甲基化酶基因還攜帶AMEs基因，檢出率為50.0%，提示銅綠假單胞菌可能攜帶多種耐藥基因，共同導致我院銅綠假單胞菌氨基糖苷類抗生素耐藥。

此外，54株耐藥菌株中還有2株菌未檢出常見的21種耐藥基因，可能還存在其他的耐藥機制，有待于進一步研究。

綜上所述，我院臨床分離的銅綠假單胞菌攜帶多種16S rRNA甲基化酶基因和AMEs基因，應密切監控其對氨基糖苷類抗生素的耐藥性及其耐藥機制，防止耐藥株流行和播散，為臨床合理選擇抗菌藥物提供可靠的實驗室依據。

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