維生素D3對博來霉素誘發(fā)小鼠肺纖維化的影響

王 熹，趙 卉，徐德祥，陳遠(yuǎn)華

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一類慢性間質(zhì)性肺疾病，以肺泡上皮細(xì)胞損傷、成纖維細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)聚集增多為病理特征[1]。IPF是最常見的肺部疾病之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，早期診斷較為困難，預(yù)后極差。博來霉素(bleomycin , BLM)是一種廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，常在實驗中用于誘導(dǎo)小鼠肺纖維化，BLM誘導(dǎo)的肺纖維化，與人類的特發(fā)性肺纖維化相類似，是最常用的研究特發(fā)性肺纖維化的模型[2]。由于尚無有效方法治療特發(fā)性肺纖維化，急需嘗試新的預(yù)防和治療性干預(yù)措施以預(yù)防特發(fā)性肺纖維化。越來越多研究[3-4]證明，活性氧可能在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化中起關(guān)鍵作用，活性氮也參與其中，同時，大量研究[5]表明，抗氧化治療具有一定的抗肺纖維化作用。維生素D(Vitamin D，VitD)是脂溶性開環(huán)類固醇激素。人體維生素D主要通過光照由皮膚合成，少量由食物攝入[6]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，維生素D在鈣吸收和骨骼代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用[7]。最近研究[8]表明，維生素D也具有抗氧化劑作用。維生素D本身缺乏生物活性。維生素D在肝臟細(xì)胞色素P450(CYP)2R1作用下首先轉(zhuǎn)化為25-(OH)-D3，25-(OH)-D3在腎臟CYP27B1作用下進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成活性型1,25-(OH)2-D3(即骨化三醇)[9]。該研究旨在探討維生素D3對BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1化學(xué)試劑博來霉素和維生素D3購自美國Sigma Chemical公司；3-硝基酪氨酸抗體購自美國Santa Cruz Biottchnologies公司；TRIzol總RNA提取試劑購自美國分子研究中心；DNA酶和實時PCR擴(kuò)增試劑盒購自美國Promega公司；化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測設(shè)備購自皮爾斯生物技術(shù)公司；引物由美國Life Technologies公司合成。

1.2實驗動物成年的C57BL/6J雄性小鼠(8周大小，24～26 g)購自北京維通利華公司，實驗前動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲食，晝夜節(jié)律，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度(50±5)%。

1.3方法

1.3.1動物分組、處理 96只成年C57BL/6J雄性小鼠隨機(jī)分為如下8組：生理鹽水對照組(對照組)，單純維生素D3組(VitD3組)，博來霉素組(BLM 1 d組、BLM 7 d組和BLM 21 d組)，維生素D3+博來霉素組(VitD3+ BLM 1 d組、VitD3+BLM 7d組和VitD3+ BLM 21 d組)。BLM組和VitD3+ BLM組小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射給予單次博萊霉素(3.0 mg/kg)，對照組和VitD3小鼠經(jīng)氣管內(nèi)注射給予等量生理鹽水。VitD3+BLM組小鼠在BLM處理前30 min以及處理后每天經(jīng)腹腔給予1次1 μg/kg的1,25(OH)2D3(活性維生素D3)，對照組、BLM組和VitD3組給予等量的生理鹽水或1,25(OH)2D3。1,25(OH)2D3劑量參照文獻(xiàn)[10]。對照組、VitD3組于氣管內(nèi)生理鹽水注射后21 d剖殺，余組分別于BLM處理后1 d、7 d、21 d剖殺，取左肺組織做石蠟切片和HE染色，取右肺放置在-80 ℃冰箱內(nèi)用于RT-PCR。

圖1 肺臟的HE染色 ×100

1.3.2肺組織病理學(xué) 將留取的肺組織標(biāo)本固定在4%福爾馬林中并按照標(biāo)準(zhǔn)的程序嵌入石蠟中包埋，用石蠟包埋的肺組織行連續(xù)切片，至少將5張連續(xù)的切片行HE染色。

1.3.3實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) 運(yùn)用TRIzol總RNA提取試劑提取肺臟組織總RNA，在280 nm及260 nm波長下運(yùn)用分光光度計測樣品的吸光度值，進(jìn)行RNA完整性驗證及其濃度計算。稀釋總RNA樣品定量成0.5 μg/ml，進(jìn)行DNA的消化、逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。將cDNA 1 μl，MIX 10 μg，模板鏈和隨從鏈引物各1 μl，無酶水7 μl，置入RT-PCR擴(kuò)增儀，通過變性、退火、延伸3個步驟進(jìn)行擴(kuò)增，運(yùn)用專用軟件計算目標(biāo)基因的相對值。各基因引物序列見表1。

1.3.4肺組織免疫組化學(xué)檢測 隨機(jī)從每組肺臟組織切片中選取5張 ，烤箱烤片后二甲苯脫蠟，依次梯度濃度乙醇水化，然后滴加TritonX-100通透細(xì)胞，再滴加10%過氧化氫進(jìn)行封閉，后枸櫞酸鈉緩沖液中微波修復(fù)抗原3次，每次5 min，間隔10 min。冷卻至室溫后滴入5%的羊血清濕盒內(nèi)靜置20 min，然后在組織表面滴注3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)一抗孵育，放置4 ℃冰箱孵育過夜。然后相應(yīng)進(jìn)行二抗孵育，SP反應(yīng)，最后用DAB顯色，在光鏡下進(jìn)行觀察顯色，顯色充分后進(jìn)行復(fù)染、脫水、透明、封片。每張片子隨機(jī)取5個高倍鏡視野在光學(xué)顯微鏡下觀察，使用 Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件半定量分析各個視野下棕黃色區(qū)域占整個該視野面積的比例。

表1 各基因引物序列

2 結(jié)果

2.1維生素D3對博萊霉素所致小鼠肺纖維化的影響肺組織HE染色結(jié)果提示，與對照組對比，BLM組小鼠給藥7 d、21 d后肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，7 d開始出現(xiàn)肺泡間隔增厚，21 d肺間隔明顯增寬、成纖維細(xì)胞增生、膠原沉積。VitD3顯著減輕BLM引起的肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增寬和肺纖維化。見圖1。

圖2 肺臟的3-NT免疫組化染色 SP×400

A:對照組；B:VitD3組；C:BLM 1 d組；D:VitD3+ BLM 1 d組；E:BLM 7 d組；F:VitD3+ BLM 7 d組；G:BLM 21 d組；H:VitD3+ BLM 21 d組

2.2維生素D3對博萊霉素所致肺蛋白質(zhì)硝化的影響B(tài)LM組小鼠肺組織中棕黃色顯色區(qū)域定量較對照組明顯增多(P<0.01)，蛋白質(zhì)硝化隨時間延長而增加，其中7 d達(dá)到峰值，21 d時有所下降，而VitD3+BLM組小鼠肺組織中棕黃色區(qū)域定量與BLM組對比明顯減少(P<0.01)，說明維生素D3抑制了BLM所致的蛋白硝化反應(yīng)。見圖2、3。

圖3 3-NT 免疫組織化學(xué)染色相對表達(dá)量

1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:**P<0.01；與BLM組比較:##P<0.01

2.3維生素D3對博萊霉素上調(diào)小鼠肺NADPH氧化酶基因的影響與對照組對比，BLM組小鼠肺NADPH氧化酶基因p47phox在給藥后1、7 d上調(diào)(P<0.05)，p67phox在給藥后7、21 d明顯上調(diào)(P<0.01)。VitD3顯著減輕BLM引起的小鼠肺p47phox和p67phox基因的上調(diào)。單純維生素D3組與對照組比較氧化酶基因表達(dá)無明顯變化。見圖4。

圖4 各組小鼠肺臟NADPH氧化酶mRNA表達(dá)情況

A：p47phox；B：p67phox；1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01；與BLM組比較:#P<0.05，##P<0.01

2.4維生素D3對博萊霉素下調(diào)小鼠肺抗氧化酶基因的影響與對照組比較，BLM組小鼠肺抗氧化酶基因超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)1在給藥后1、7和21 d明顯下調(diào)(P<0.01)，sod2在1d明顯下調(diào)(P<0.01)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，gshpx)在21 d明顯下調(diào)(P<0.01)，VitD3顯著對抗BLM引起的小鼠肺sod1、sod2、gshpx基因表達(dá)下調(diào)。BLM對谷胱甘肽還原酶基因(glutathione reductase，gshrd)表達(dá)影響很小，然而VitD3+BLM組gshrd基因表達(dá)明顯升高(P<0.01)。單純維生素D3組與對照組比較抗氧化酶基因表達(dá)無明顯變化。見圖5。

A：sod1；B：sod2；C：gshpx；D：gshrd；1:對照組；2:VitD3組；3:BLM 1 d組；4:VitD3+ BLM 1 d組；5:BLM 7 d組；6:VitD3+ BLM 7 d組；7:BLM 21 d組；8:VitD3+ BLM 21 d組；與對照組比較:**P<0.01；與BLM組比較:#P<0.05，##P<0.01

3 討論

肺纖維化是一種慢性肺部疾病，其病理機(jī)制仍不明確，目前暫無有效的治療藥物。目前研究肺纖維化多數(shù)運(yùn)用BLM誘導(dǎo)的肺纖維化模型，本研究成功復(fù)制BLM肺纖維化模型，并給予VitD3進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，維生素D3明顯減輕了BLM處理后7 d、21 d肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞、肺間隔增厚、纖維細(xì)胞增生以及膠原沉積。上述結(jié)果提示：維生素D3明顯減輕了BLM引起的肺纖維化，這與早前研究報道維生素D3能改善BLM誘發(fā)小鼠肺纖維化相一致[11]。

隨著氧化應(yīng)激研究的深入，目前有研究[3]表明氧化應(yīng)激在肺纖維化過程中起重要作用。另有研究[12]提示VitD3可以減輕LPS誘發(fā)的急性腎損傷中的氧化應(yīng)激，其主要機(jī)制是調(diào)節(jié)氧化酶和抗氧化酶基因的表達(dá)。因此設(shè)想VitD3保護(hù)BLM誘發(fā)肺纖維化的機(jī)制與抗氧化應(yīng)激相關(guān)。本研究結(jié)果顯示BLM所致肺纖維化模型中小鼠肺NADPH氧化酶p47phox和p67phox基因分別在給藥后1 d、7 d和7 d、21 d明顯上調(diào)，同時抗氧化酶sod1在給藥后1 d、7 d和21 d明顯下調(diào)，sod2基因在1 d明顯下調(diào)，gshpx基因在21 d明顯下調(diào)，上述結(jié)果表明BLM所致肺纖維化中存在氧化酶基因上調(diào)和抗氧化酶基因下調(diào)，各種酶基因表達(dá)調(diào)節(jié)時間及時限不同，抗氧化酶以sod為主。VitD3處理顯著減弱了BLM所致的肺NADPH氧化酶基因表達(dá)的上調(diào)和抗氧化酶基因表達(dá)的下調(diào)。此外，本研究免疫組化結(jié)果顯示BLM所致肺纖維化模型中蛋白質(zhì)硝化標(biāo)志3-NT殘留定量明顯增多，而VitD3明顯減少了BLM所致3-NT殘留。綜上所述：維生素D3抑制BLM所致肺纖維化過程中氧化應(yīng)激，其可能的機(jī)制是下調(diào)氧化酶基因及上調(diào)抗氧化酶基因的表達(dá)。

目前，很多研究[13-14]顯示BLM誘發(fā)肺纖維化的機(jī)制可能與炎癥、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等領(lǐng)域相關(guān)。而前期研究[10,15]表明維生素D3抑制BLM誘導(dǎo)的肺部炎癥以及內(nèi)皮細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。本研究僅闡述維生素D3對BLM所致肺纖維化具有保護(hù)作用以及可能的機(jī)制是減輕其過程中的氧化應(yīng)激，但維生素D3是直接影響氧化應(yīng)激，還是通過改善炎癥、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等間接影響氧化應(yīng)激，抑或是作用三個機(jī)制共同起到保護(hù)作用，本研究暫未闡明，有待進(jìn)一步的研究?？傊狙芯拷Y(jié)果表明維生素D3對肺纖維化起保護(hù)作用及部分機(jī)制，并對臨床治療提出新的方向。

[1] Sergew A. Advances in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Expert Opin Emerg Drugs, 2015, 20(4): 537-52.

[2] Moore B B. Murine models of pulmonary fibrosis[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2008, 294(2): L152-60.

[3] Cheresh P, Kim S J, Tulasiram S. Oxidative stress and pulmonary fibrosis[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1832(7): 1028-40.

[4] Hsu Y C, Wang L F. Nitric oxide in the pathogenesis of diffuse pulmonary fibrosis[J]. Free Radic Biol Med, 2007, 42(5): 599-607.

[5] Day B J. Antioxidants as potential therapeutics for lung fibrosis[J]. Antioxid Redox Signal, 2008, 10(2): 355-70.

[7] Holick M F. Resurrection of vitamin D deficiency and rickets[J]. J Clin Invest, 2006, 116(8): 2062-72.

[8] Zhong W, Gu B, Gu Y, et al. Activation of vitamin D receptor promotes VEGF and CuZn-SOD expression in endothelial cells[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2014, 140: 56-62.

[9] Bikle D D. Vitamin D metabolism, mechanism of action, and clinical applications[J]. Chem Biol, 2014, 21(3): 319-29.

[10] Tan Z X, Chen Y H, Xu S, et al. Calcitriol inhibits bleomycin-induced early pulmonary inflammatory response and epithelial-mesenchymal transition in mice[J]. Toxicol Lett, 2016, 240(1): 161-71.

[11] Zhang Z, Yu X, Fang X, et al. Preventive effects of vitamin D treatment on bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Sci Rep, 2015, 5: 17638.

[12] Xu S, Chen Y H, Tan Z X, et al. Vitamin D3 pretreatment alleviates renal oxidative stress in lipopolysaccharide-induced acute kidney injury[J]. J Steroid Biochem Mol Biol, 2015, 152: 133-41.

[13] Todd N W, Luzina I G. Molecular and cellular mechanisms of pulmonary fibrosis[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2012, 5(1): 11.

[14] Hotamisligil G S. Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis of metabolic disease[J]. Cell, 2010, 140(6): 900-17.

[15] Haas M J, Jafri M, Wehmeier K R, et al. Inhibition of endoplasmic reticulum stress and oxidative stress by vitamin D in endothelial cells[J]. Free Radic Biol Med, 2016, 99:1-10.