白細胞介素-1β在類青光眼引流閥植入術后瘢痕化中的作用

張康玉，蔣正軒，劉 超，夏 洋，鮑穎超，陶黎明

青光眼是以視神經損傷及視功能損害為特征的一組疾病，是世界首位不可逆轉的致盲性眼病。難治性青光眼是一組病情復雜、手術成功率相對較低、術后并發癥較多的眼病。目前青光眼引流閥植入術是難治性青光眼主要手術方法，術后早期成功率約80%，遠期成功只有約50%[1]。而其手術失敗的主要原因為術后引流閥周圍較重炎癥反應及成纖維細胞增生，導致引流閥纖維包裹，引流受阻，造成眼壓再次升高。目前在成纖維細胞增生和瘢痕化形成中發現很多相關性標志物，主要集中在炎性細胞因子的研究，其中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)具有廣泛的生物學性，被認為是最重要的炎性因子。

IL-1β是一種分泌型調節蛋白，由巨噬細胞、小膠質細胞及成纖維細胞等多種細胞分泌，是白介素-1的主要分泌形式，是一種重要的促炎因子，在炎癥、自身免疫性疾病及體內組織損傷修復中發揮著重要的作用。該文通過將Parylene C涂層包裹的PMMA和硅膠兩種不同引流閥材料植入新西蘭大白兔球結膜下，預形成不同的瘢痕組織，比較在不同瘢痕化的組織中IL-1β蛋白的表達及其對成纖維細胞增生的影響。

1 材料及方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物 正常清潔成年新西蘭大白兔30只(安徽醫科大學動物實驗中心提供)，體量約2.5 kg，雌雄不限。大白兔飼養于安徽醫科大學動物實驗中心，單個分籠喂養、自由飲水及進食，室溫為25 ℃左右，明暗各12 h周期性光照。

1.1.2實驗儀器 光學顯微鏡(上海醫光儀器有限公司);Western blot曝光機(上海Tanon公司);Western blot電泳及轉膜電源(美國Bio-Rad公司)；石蠟切片機(德國Leica公司)；熒光正置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.1.3實驗試劑 Parylene C涂層包裹的PMMA(美國加州大學提供)；硅膠(安徽醫科大學第二附屬醫院提供)；IL-1β一抗(北京Bioss bs-20448R)；GAPDH一抗(美國Proteintench 60004-1-Ig)；辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(ZB-2305)、辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(ZB-2301)、兔二步法試劑盒(PV-6001)(北京中杉金橋公司)；Western blot發光試劑(美國Thermo公司)；組織蛋白提取試劑及Western blot配膠試劑(上海碧云天生物有限公司)。

1.2試驗方法

1.2.1實驗動物分組、模型及處理 將30只新西蘭大白兔采用隨機數字表法將其分為硅膠組和新材料組，每組15只，任選一側眼作為手術眼。所有動物術前1 d給予眼部及全身健康排查，均呼吸平穩，眼表清潔、無明顯炎癥及瘢痕等疾患，手術均在同一手術室，由同一個操作熟練的眼科醫師操作。術前經耳緣靜脈給予3%戊巴比妥鈉40 mg/kg全身麻醉，5%鹽酸丙美卡因滴眼液點眼結膜囊內行表面麻醉。麻醉滿意后，常規消毒鋪巾，縫線固定開瞼，慶大霉素稀釋液沖洗結膜囊，自上方角膜緣打開球結膜，充分分離球結膜與鞏膜，球結膜下分別植入大小約5 mm×5 mm硅膠片和Parylene C涂層包裹的PMMA片，用10～0的絲線間斷縫合，在球結膜囊涂適量妥布霉素地塞米松眼膏，術閉。術后1、4、8周各組取5只大白兔行過量麻醉后，取自球結膜至鞏膜全層組織(去除縫線和植入物)，生理鹽水反復清洗組織后一半置于10%多聚甲醛溶液中固定，一半組織置于液氮中，后保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2蘇木精-伊紅(HE)染色法 將固定在10%多聚甲醛溶液中的組織經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織形態、拍攝照片。高倍鏡(400×)下計數成纖維細胞。

1.2.3免疫組化 取1.2.2部分制備的石蠟切片，常規脫蠟、胰蛋白酶消化修復抗原，H2O2去離子水孵育消除內源性過氧化物酶活性，加IL-1β一抗、生物素標記二抗、辣根過氧化物酶標記鏈霉素工作液，DAB顯色劑室溫下顯色10 min，蒸餾水沖洗終止顯色；脫水，透明，封片，光學顯微鏡下觀察，以組織中出現棕黃色染色為陽性表達。任意選取各組石蠟切片各5張，光學顯微鏡(400×)下觀察并拍照。用JEOR 801D形態學圖像分析系統采集分析處理圖像，測定平均吸光度值。

1.2.4Western blot 將-80 ℃冰箱中保存的組織，加RIPA和PMSF在液氮環境下研磨、裂解后，離心、收集上清液獲得總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，4倍體積加入(5×)上樣緩沖液。每孔加入30 μg蛋白樣品在SDS-PAGE膠中分離，低溫轉印至PVDF膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次、每次10 min ，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5次、每次10 min，加顯影液曝光拍照保存。GAPDH為內參。采用 Scion Image 軟件分別分析獲得IL-1β及GAPDH灰度值，并計算IL-1β/GAPDH灰度值比值為IL-1β的相對表達量。

1.2.5相關性分析 高倍鏡下計數HE染色切片中的成纖維細胞數，分析統計同一組織相同的視野下免疫組化中IL-1β的平均光密度，計算線性相關系數，推算IL-1β與成纖維細胞的相關性。

2 結果

2.1HE染色硅膠組、新材料組術后均有明顯的炎細胞浸潤和纖維細胞增生。1周組織：硅膠組較新材料組有更多炎細胞浸潤、新生血管和肉芽組織，且細胞核增大、深染、分裂象增多。4周組織：兩組的炎細胞均較1周時減輕，成纖維細胞增多。硅膠組較新材料組可見較多紊亂的成纖維細胞，巢狀分布，膠原纖維密集、彼此交織，呈波浪狀，伴有明顯的炎細胞浸潤。8周組織：兩組較4周組織中的炎細胞明顯減輕，新材料組已無明顯的炎細胞浸潤，硅膠組較新材料組仍有較多炎細胞，膠原纖維更為致密、排列更紊亂呈波紋狀或年輪狀。見圖1。

2.2免疫組化兩組術后組織中均有炎細胞IL-1β的表達，細胞中見棕褐色陽性染色，主要分布胞質中，且集中在近鞏膜面的增殖的成纖維細胞周圍(4、8周表現明顯)。1周組織：兩組IL-1β均明顯增多，硅膠組較新材料組增加更顯著(t=2.565，P<0.05)；4周組織：兩組IL-1β較1周均減少，但硅膠組仍較新材料組多(t=3.122，P<0.05)；8周組織：兩組IL-1β較4周均再次減少，硅膠組仍比較多，而新材料組IL-1β明顯減少(t=3.350，P<0.01)。見圖2、3。

2.3Westernblot兩組術后IL-1β的表達均增高，1周增高最顯著， 4周和8周 IL-1β的表達逐漸減少，各個時間段硅膠組的表達均高于新材料組，兩組間差異有統計學意義：1周(t=2.526，P<0.05)，4周(t=2.474，P<0.05)，8周(t=4.244，P<0.01)。見圖4、5。

圖1 兩組不同時期中HE染色結果 ×400

圖2 兩組不同時期IL-1β免疫組化結果 ×400

項目4周IL-1β的平均吸光度成纖維細胞數8周IL-1β的平均吸光度成纖維細胞數硅膠0.420 6±0.092 6155.600 0±6.503 9 0.323 4±0.060 7126.200 0±8.983 3新材料0.265 6±0.006 1133.600 0±17.285 8 0.215 4±0.038 899.400 0±12.074 8r值0.7050.851P值0.0230.002

圖3 統計分析比較兩組不同時期IL-1β的平均光密度值

圖4 兩組不同時期Western blot檢測IL-1β表達結果

圖5 統計分析比較兩組不同時期IL-1β的相對表達量

2.4相關性分析高倍鏡(400×)下計數單位面積(150 μm×150 μm)HE染色切片中的成纖維細胞數，分析統計同一組織相同的視野下免疫組化中IL-1β的平均光密度值，計算4周和8周的IL-1β的平均光密度值與成纖維細胞數的相關系數，4周：(r=0.705，P<0.05)，8周：(r=0.851，P<0.01)。見表1、圖6。

圖6 兩組IL-1β的平均吸光度與成纖維細胞數散點圖

3 討論

青光眼是以視力降低、視野缺損及眼球疼痛為主要癥狀的一組疾病，眼內壓升高是其主要的危險因素。青光眼具有高發病率(總人群發病率為1%，45歲以后為2%[2])、不可逆性視力損傷及難治性(手術成功率約70%～90%[3])等特征。特別是難治性青光眼，目前青光眼引流閥的植入為主要治療手段[4-5]，引流閥作為異物植入人體后將引起免疫反應，加劇炎癥反應及瘢痕的形成，手術后成功率較低，治療相當棘手。因此探討炎癥因子IL-1β在青光眼引流閥術后的表達及其對瘢痕化的影響有重要的意義。

不同植入材質因其組織相容性不同，引起的炎癥及免疫反應程度亦不相同。本次研究的新材料組是Parylene C薄層涂層于PMMA表面作為新的青光眼引流閥材料。Parylene C是一種熱塑性的高分子材料，為惰性的高分子聚合物，因具有良好的生物相容性、耐腐性、化學穩定性[6]，已廣泛用于膠塞鍍膜、心臟封堵器、口腔填塞物等器材植入人體內，且相關臨床研究亦驗證其具有良好的組織相容性、臨床有效性及安全性[7-9]。且研究[10]顯示，Parylene C具有很好地抑制炎癥作用，涂層于植入物表面有很好地抑制炎癥反應作用，若涂層于青光眼引流閥表面會因抑制炎癥作用，可能會有抑制成纖維細胞增生，減少瘢痕形成的作用。本實驗使用Parylene C 涂層包裹的PMMA作為新材料，和硅膠分別植入大白兔球結膜下，術后結果顯示新材料組炎癥反應及成纖維細胞增生明顯輕于硅膠組，成功造出不同的瘢痕模型。同時本研究也證實了Parylene C具有抑制炎癥反應及成纖維細胞增生的作用。

IL-1β是一種具有多種生物活性的細胞因子，既能從局部及系統兩方面調節炎性反應，又能在組織損傷過程中發揮極其重要的作用。Santak et al[11]發現IL-1β能夠抑制I型前膠原的mRNA生成,可以從轉錄和翻譯兩個水平影響成纖維細胞合成，促進膠原蛋白的分解。然而Kim et al[12]研究發現IL-1β有促進炎癥因子浸潤和瘢痕形成的作用。本研究顯示，IL-1β的表達水平與成纖維細胞在硅膠組明顯增多，提示可能參與了瘢痕化的過程；同時IL-1β分子主要表達于成纖維細胞周圍，提示IL-1β可能參與了成纖維細胞的增生；進一步分析顯示IL-1β與成纖維細胞的增生成正相關性。這些結果表明IL-1β可以促進成纖維細胞的增生，促進瘢痕形成。

IL-1β是由巨噬細胞、內皮細胞、小膠質細胞及成纖維細胞等多種細胞分泌一種炎性因子，由Toll樣受體、Nod樣受體通路以及Caspase-1通路進行調節和激活。首先，IL-1β可促進前列腺素、一氧化氮合酶等炎癥介質的釋放，誘導加劇炎癥反應，參與炎癥反應的發生及發展[13]，從而延長術后愈合時間，加重成纖維細胞增生。其次，IL-1β又可通過促進成纖維細胞因子生成、基質金屬蛋白酶的釋放，特別是與基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的有相互促進的作用。MMP-9是一種糖蛋白，因具有Ⅴ型膠原功能域，又被稱作明膠酶B，屬于明膠酶類[14]，其主要作用是分解細胞外基質，加重瘢痕作用。IL-1β促進MMP-9的釋放，破壞細胞外基質而加重瘢痕化的作用。再次，損傷后IL-1β可以與血管內皮細胞表面受體結合，可上調凋亡蛋白Bax以及下調Bcl2，誘導釋放細胞色素C，從而活化Caspase-3而致內皮細胞凋亡[15]，加重出血及炎癥因子的釋放，亦可加重成纖維細胞的增生。

綜上所述，本實驗結果顯示IL-1β在類青光眼引流閥植入術后表達明顯增高，且與成纖維細胞的增生成正相關性，提示IL-1β可能有促進青光眼引流閥植入術后成纖維細胞增生、加重瘢痕化的作用。后期仍需更多的研究明確IL-1β通過何種通路促進成纖維細胞的增生。

[1] Riva I, Roberti G, Oddone F, et al. Ahmed glaucoma valve implant: surgical technique and complications[J]. Clin Ophthal, 2017, 11: 357-67.

[2] Kang J Y, Nam K Y, Lee S J, et al. The effect of intravitreal bey-acizumab injection before Ahmed valve implantation in patients with neovascular glaucoma[J]. Int Ophthalmol, 2014, 34(4): 793-9.

[3] Gandham S B, Costa V P, Katz L J, et al. Aqueous tube-shunt implantation and pars plana vitrectomy in eyes with refractory glaucoma[J]. Am J Ophthalmol, 1993, 116(2): 189-95.

[4] Gedde S J, Schiffman J C, Feuer W J, et al. Treatment outcomes in the Tube Versus Trabeculectomy (TVT) study after five years of follow-up[J]. Am J Ophthalmol, 2012, 153(5): 789-803.

[5] Gedde S J, Heuer D K, Parrish R K, et al. Review of results from the Tube Versus Trabeculectomy study[J]. Curr Opin Ophthalmol, 2010, 21(2): 123-8.

[6] Miksa B J, Sochacki M, Sroka-Bartnicka A, et al. Application of parylene for surface (polymer) enhanced laser desorption/ionization of synthetic polymers[J]. Rapid Commun Mass Spectrom: RCM, 2013, 27(7): 767-72.

[7] 秦 莉, 易豈建, 李 謐, 等. Parylene涂層封堵器治療兒童先天性心臟病療效觀察[J]. 重慶醫科大學學報, 2014, 39(10): 1403-9.

[8] Fergus C, Santos M, Soo S, et al. The effect of different chemical intra-oral prostheses cleansers on the surface properties of Parylene-coated PMMA[J]. Dent Mater J, 2017, 36(2): 129-34.

[9] Park C J, Yang D S, Cha J J, et al. Polymeric check valve with an elevated pedestal for precise cracking pressure in a glaucoma drainage device[J]. Biomed Microdevices, 2016, 18(1): 20.

[10] Robinson E, Kaushal S, Alaboson J, et al. Combinatorial release of dexamethasone and amiodarone from a nano-structured parylene-C film to reduce perioperative inflammation and atrial fibrillation[J]. Nanoscale, 2016, 8(7): 4267-75.

[11] Santak G, Santak M, Forcic D. The role of interleukin-lbeta and platelet-derived growth factor-AB in antifibrosis mediated by native human interferon alpha[J]. Surgery, 2010, 148 (3): 490-8.

[12] Kim K H, Ko A Y, Ryu J S, et al. Effect of electrocauterization on the inflammation of the conjunctiva in experimental animal model[J]. Korean J Ophthalmol, 2013, 27(4): 282-7.

[13] 黃云帆, 彭禮波, 張志堅. 細胞焦亡與炎癥反應的研究進展[J]. 海南醫學, 2016, 27(21): 3533-5.

[14] Wang J J, Huan S K, Hsieh K H, et al. Inhibitory effect of midazolam on MMP-9, MMP-1 and MMP-13 expression in PMA-stimulated human chondrocytesviarecovery of NF-kappa B signaling[J]. Arch Med Sci, 2013, 9(2): 332-9.

[15] Zhu X, Xie M, Wang K, et al. The effect of puerarin against IL-1β-mediated leukostasis and apoptosisin retinal capillary endothelial cells (TR-iBRB2)[J]. Mol Vis, 2014, 20:1815-23.