曲美他嗪對心力衰竭犬氧化應激狀態的影響

霍 紅，王鳳榮

心力衰竭是心臟疾病的終末期表現，最終導致心肌結構和功能的改變，其發病機制復雜。眾多研究[1]表明，氧化應激與心力衰竭的整個過程密切相關。在正常的生理情況下，機體對活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生和清除處于動態調節狀態，這種平衡一旦被打破，就會造成心肌能量代謝的紊亂及心肌細胞的損傷[2]。曲美他嗪是優化心肌能量代謝的藥物，能夠在心肌缺血狀態下，改善心肌能量代謝，保護心肌細胞。該研究通過觀察曲美他嗪對心衰犬超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)mRNA表達以及心肌細胞結構的影響, 探討其改善心衰犬氧化應激狀態的可能機制。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器曲美他嗪(法國施維雅公司，批號：J20030554)；丙二醛測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RT-PCR試劑盒(上海寶生物公司，貨號：DRR019A)；超氧化物歧化酶測試盒 (南京建成生物工程研究所)；實驗用起搏器(400 次/min，電壓閾值<1 V，阻抗500～1 000 Ω，上海復旦大學電子工程室)；光學顯微鏡(日本Olympus公司)；透射電鏡(JEM-1200EX，日本JEOL公司)；紫外線分光光度儀(Ultrospec3000，英國Phamacia Biotech公司)。

1.2動物模型及分組15只雜種犬，體質量18～20 kg，由哈爾濱醫科大學實驗動物中心提供。犬心衰模型的制備：15只犬隨機分為假手術組、模型組、曲美他嗪組，每組5只。假手術組只開胸，不安裝起搏器；余兩組均以快速起搏右心室6周構建心衰模型，曲美他嗪組于起搏后2 d每日灌胃給予曲美他嗪[5 mg/(kg·d)]。6周后關閉起搏器，觀察犬生活狀態，并檢測三組犬心功能。與假手術組犬比較，模型組犬活動耐力下降，平靜時呼吸急促，活動后氣促加重，食欲減退，腹脹，尿量減少，肺部可聞及濕啰音。曲美他嗪組犬活動耐量稍減退，活動后氣促，肺部偶可聞少許濕啰音。與假手術組犬相比，余兩組犬心臟均有不同程度擴大，射血分數下降，提示造模成功。

標本采集：6周后，3組犬均以左側胸廓切開術切除心臟。快速切取左室心肌組織，取約100 mg大小組織塊，置于液氮速凍后，-80 ℃存放。

1.3心肌組織MDA和SOD活性的測定心肌組織稱重、剪碎，按 1 ∶9 濃度加入4 ℃勻漿介質，充分研磨，制成10%勻漿低溫高速離心后，棄上清液，沉淀物加入少許勻漿介質制成懸濁液。MDA采用硫代巴比妥法檢測，SOD采用黃嘌呤氧化酶法檢測。

1.4逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) RNA提取及逆轉錄：心肌組織100 mg用TRIzol法提取組織總RNA。將RNA溶于20 μl DEPC水中，-80 ℃凍存備用。取5 μl總RNA稀釋，1%的瓊脂糖電泳證實RNA的完整性后, 用紫外線分光光度儀測定總RNA的純度[1.8

PCR聚合酶鏈反應：按照二步法RT-PCR試劑盒提供的說明書加入逆轉錄反應所需試劑合成cDNA, PCR引物設計：PDH(205 bp)上游引物序列為5′-GTGTTGTCGGGCGTCTC-3′；下游引物序列為5′-CTGCCTTTAACTCCATTCG-3′；β-actin(379 bp)上游引物序列為5′-CAGAGCAAGAGGGGCATC-3′；下游引物序列為5′-AGGTAGTCGGTCAGGTCC-3′。PCR循環體系，94 ℃預變性2 min；94 ℃變性 30 s；(PDH：58 ℃，β-actin：57 ℃)退火30 s，72 ℃延伸 2 min；30個循環。PCR循環后72 ℃再延伸10 min。

電泳及圖像掃描：PDH和β-actin擴增的產物電泳(電泳條件：1.5%瓊脂糖，電壓150 V/cm，電流350 mA，時間30 min)后，經凝膠成像系統分析處理，分別計算PDH和β-actin條帶的灰度比值作為其mRNA的相對表達量。電泳條帶回收純化后送DNA序列分析。

1.5光鏡下觀察心室肌病理組織學變化各組犬心肌組織塊置入4%多聚甲醛固定，4 ℃保存；標本脫水、透明后，石蠟包埋，制備切片，常規HE染色。光鏡下每例犬選取8張切片，每張切片至少分析200個細胞(可見細胞核)，計算肌溶解細胞占細胞總數的百分比，記做肌溶解比率。采用計算機病理圖像分析系統，計算肌溶解面積占整個細胞面積百分比，按照肌溶解面積分為：輕度肌溶解(10%～25%)，重度肌溶解(﹥25%)。

1.6電鏡下觀察心室肌超微結構組織塊置入3%戊二醛中固定，4 ℃保存；標本經乙醇逐級脫水后，用1 ∶1比例混合的丙酮和包埋劑室溫下浸透1 h，再用純包埋劑進行包埋、固化，先制備半薄切片(0.5～1.0 μm)，定位后制成超薄切片(50～100 nm)；最后用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，經漂洗、分化，待干觀察。

2 結果

2.1犬心肌組織MDA和SOD含量的比較與假手術組比較，模型組與曲美他嗪組心室肌細胞中MDA增高，SOD減低(P<0.05)。與模型組比較，曲美他嗪組MDA降低，SOD增高(P<0.05)。見表1。

表1 犬心肌組織MDA和SOD含量的比較與心室肌PDH與β-actin灰度的比值

與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

2.2各組犬心室肌PDHmRNA相對表達量以2 000 bp DNA Ladder的Marker為標志，在205 bp和392 bp處可見擴增產物，經測序證實為PDH mRNA和β-actin的編碼基因片斷。與假手術組犬相比，模型組犬心室肌PDH mRNA表達顯著降低(P<0.01)；曲美他嗪組犬心室肌PDH mRNA表達較模型組明顯增加(P<0.05)，但仍低于假手術組(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組犬心室肌PDH mRNA表達

2.3各組犬心室肌病理組織學改變假手術組心肌細胞排列有序、結構正常。模型組心肌細胞失去正常有序排列，極向紊亂，出現壓迫性萎縮或代償性肥大；細胞核畸形大小不一；心肌纖維溶解，部分區肥大；細胞核畸形大小不一；心肌纖維溶解，部分區域肌溶解嚴重；心肌間質可見纖維組織增生。與模型組比較，曲美他嗪組犬心肌病理組織學改變顯著減輕。見表2、圖2。

圖2 各組犬心肌 HE染色×400

圖3 各組犬心房肌電鏡下超微結構 ×5 000

表2 各組犬心室肌肌溶解情況

與假手術組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.4各組犬心室肌超微結構改變假手術組：心肌超微結構基本完好；肌節結構完整，各帶清晰；細胞核發育正常，核仁明顯，有豐富的線粒體，嵴清晰；閏盤發育良好。模型組：心肌纖維溶解、缺失，排列稀疏；細胞核固縮非常明顯；核周細胞器消失；細胞間連接形成高電子密度的斑塊；線粒體腫脹，大小不一，嵴減少、變短、甚至溶解，可見巨線粒體；細胞間質水腫，可見吞噬細胞和淋巴細胞，吞噬細胞內可見大量溶酶體；個別肌細胞完全溶解；間質結締組織細胞增多。曲美他嗪組：與模型組比較，犬心肌超微結構改變程度明顯減輕。見圖3。

3 討論

氧化應激是指機體內ROS產生過多或(和)清除能力降低，導致機體氧化/抗氧化系統的代謝失平衡。ROS由氧化還原反應產生，生物功能是參與信號轉導和免疫防御等生理過程，但病理狀態下過多的ROS介導氧化應激，損傷心肌。氧化應激作為心力衰竭的發病機制之一，影響疾病進展的多個環節[3]。

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)(NADH/NADPH)是細胞內參與糖、脂肪、蛋白質新陳代謝的輔酶對，是重要的電子供體，參與機體大部分的氧化還原反應[4]。能量充足情況下，腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)作為磷酸供體，NADH發生磷酸化生成NADPH。NADPH的合成是NADH的主要消耗反應之一。機體受病理條件及外源性因素影響，細胞內NADH/NADPH的水平改變，誘導ROS生成。NADH水平與ROS相關[5]。心力衰竭時ROS主要來源：① 心肌缺血低氧，ATP生成減少，膜脂質中NADH得不到氧化而堆積，ROS生成增多[6]。② 神經-內分泌系統激活，兒茶酚胺大量釋放和自由化；細胞促炎癥因子合成分泌增加；補體系統被激活等因素的刺激下，NADH/NADPH氧化系統被激活，心肌細胞產生ROS。③ 心肌能量缺乏，線粒體呼吸鏈酶活性降低，氧化磷酸化效率降低，電子傳遞發生障礙，產生ROS。總之，心衰時氧化物過度表達，抗氧化物清除能力下降，氧化及抗氧化系統的失衡造成ROS增多，細胞損傷。ROS作用于細胞膜、線粒體脂質雙分子層結構，使其發生脂質過氧化反應，膜通透性改變，溶酶體水解酶釋放；線粒體腫脹，蛋白質生成受抑制；最終導致心肌超微結構改變，心肌能量代謝障礙，ATP合成進一步減少。另外，ROS可使心肌肌漿網儲存、釋放鈣的能力下降，影響心肌收縮舒張功能，心肌功能降低，造成不可逆的損害。SOD是抗氧化酶，其活性反應氧自由基的清除能力；MDA是脂質過氧化代謝產物，含量反映脂質過氧化程度，也間接體現細胞損傷的程度。本研究中經曲美他嗪治療的心衰犬，SOD活性升高，MDA水平下降，表明曲美他嗪通過調節心肌細胞能量代謝，減輕脂質過氧化反應造成的心肌損傷，降低ROS對心肌細胞的損傷，從病理形態及超微結構的改變，可以觀察到，曲美他嗪可維護心肌細胞膜和線粒體的結構，減輕ROS 造成的心肌損傷，維持心肌細胞的基本功能。

心力衰竭的發生發展過程中伴隨著心肌能量代謝改變，而心肌的能量代謝紊亂又直接或間接促進了心肌的重構[7]。自“代謝重構”的概念提出以來，優化心肌能量代謝治療前景廣闊，在傳統藥物治療的基礎上，仍可從提高能量代謝過程中獲益。曲美他嗪是近年研究的熱點，它主要作用機制是通過抑制部分脂肪酸氧化，減少NADH的生成，從而降低NADH對PDH的抑制，使心肌代謝向高效的葡萄糖氧化轉變[8]。另外，曲美他嗪可以通過提高清除自由基的能力，抑制脂質過氧化反應，穩定細胞膜，起到保護心肌細胞、抑制心肌重構的作用[9-10]。本研究顯示曲美他嗪組PDH mRNA表達較模型組明顯增加，表明心肌細胞內葡萄糖氧化效率增加，心肌能量代謝得到優化，線粒體合成ATP相對增多，NADH/NADPH系統功能改善，NADH堆積減少，減輕ROS損傷。

目前，心力衰竭的氧化應激機制仍在研究中，氧化應激產生ROS對心肌細胞的損傷毋庸置疑，代謝治療是有前景的治療方法和途徑，但臨床上缺乏具體的調控機制研究，曲美他嗪改善NADH介導氧化應激損傷參與心力衰竭病理過程仍需進一步探討。

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