miR-17-5p在動脈粥樣硬化小鼠中的作用機(jī)制研究

譚力力，劉麗敏

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥性疾病，是缺血性心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)[1]。在世界范圍內(nèi)，心腦血管疾病是死亡率最高的疾病，因此，在AS發(fā)病早期的診斷和治療對于防治心腦血管疾病顯得尤為重要。近幾年來，micro RNA在疾病中的作用受到了廣泛的關(guān)注。一些microRNA分子已經(jīng)被證實(shí)其在血漿中的表達(dá)量與疾病發(fā)生具有較為明確的相關(guān)性[2]，甚至直接調(diào)控一些主要的通路影響疾病的發(fā)生發(fā)展，具有作為生物學(xué)標(biāo)志的應(yīng)用價值[3-4]。有研究[5]曾表明，miR-17-5p的表達(dá)水平與冠狀動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度具有相關(guān)性，但是miR-17-5p對AS的具體影響和機(jī)制尚不十分清楚，因此，該研究探討miR-17-5p在動脈粥樣硬化中對炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的影響，并初步評估m(xù)iR-17-5p在AS的診斷和治療中的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1主要試劑和材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6和ApoE-/-小鼠(雄性，6周，18～22 g)購自Vital River實(shí)驗(yàn)中心(中國北京)，根據(jù)中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院動物保護(hù)和使用委員會的標(biāo)準(zhǔn)在無病原體條件下飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)WET法測定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測定試劑盒(南京建成)；小鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA試劑盒、小鼠白介素-10(interleukin-10, IL-10)ELISA試劑盒、小鼠白介素-6(interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒(Boster)；蘇木精(Solarbio)；署紅Y，醇溶(國藥)；B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體、活化半胱天冬酶3(cleaved-caspase-3)抗體、活化多聚ADP核糖聚合酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase, cleaved-PARP]抗體(萬類生物)。

1.2方法

1.2.1動物實(shí)驗(yàn)處理 經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)動物共分為四組：① 對照組(NC)：正常喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠到第12周；② 動脈粥樣硬化模型組(AS)：用高脂膽固醇飲食(1.25 %膽固醇和21 %脂肪)喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠到第12周)；③ NC-miRNA組(NC-miRNA)：同上構(gòu)建AS小鼠模型后尾靜脈注射miRNA抑制劑陰性對照；④ miR-17-5p抑制劑組(antagomiR-17-5p)：構(gòu)建AS小鼠模型后尾靜脈注射miR-17-5p抑制劑。3周后處理小鼠分離胸主動脈，部分用多聚甲醛固定，部分凍存用于分子生物學(xué)檢測。

1.2.2HE染色 胸主動脈固定后，常規(guī)脫水、透蠟和包埋。將蠟塊標(biāo)本切成5 μm左右的薄片，溫水中鋪展，60 ℃烘干，脫蠟至水。切片置于蘇木精中染色5 min，1 %鹽酸酒精分化，自來水沖洗，再將切片置于伊紅染液中浸泡3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。擦干切片后封片于400×顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3TUNEL染色 制作胸主動脈的石蠟切片，脫蠟至水。用0.1 % Triton X-100透化，滴加3 % H2O2封閉，加入新配制的TUNEL反應(yīng)液50 μl，37 ℃避光孵育60 min，漂洗后滴加Converter-POD 50 μl，37 ℃孵育30 min，加DAB底物，待顏色剛變深時終止反應(yīng)。用蘇木精復(fù)染，1 %鹽酸酒精分化，流水反藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。中性樹膠封片，400×鏡下拍照。

1.2.4Western blot 將胸主動脈血管置于裂解液中裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離總蛋白，電泳之后轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜，二抗37 ℃孵育45 min。二抗孵育完成后，ECL法曝光，最終得到的膠片用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

1.2.5ELISA 收集動脈血管組織樣本，組織勻漿、提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用商品化的小鼠TNF-α、IL-10和IL-6 ELISA檢測試劑盒，按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后用酶標(biāo)儀于450 nm處檢測各孔的光密度(OD)值。利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣本各指標(biāo)的含量。

1.2.6MDA含量測定 收集動脈血管組織樣本，組織勻漿、提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用MDA測定試劑盒，按照試劑盒說明書操作，分光光度計(jì)測定532 nm處各管的吸光值。根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：組織中MDA含量(nmol/mg prot)=[(測定OD-空白管OD)-(標(biāo)準(zhǔn)OD-空白OD)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度÷蛋白濃度。

1.2.7SOD活性檢測 收集動脈血管組織樣本，組織勻漿、提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。采用SODWET法測定試劑盒，按照試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。根據(jù)下列公式進(jìn)行計(jì)算：SOD抑制率(%)=[(A對照-A對照空白)-(A測定-A測定空白)]/(A對照-A對照空白)×100%。

組織中SOD活力定義：在反應(yīng)體系中SOD抑制率達(dá)到50 %時所對應(yīng)的酶量為一個SOD活力單位(U)。組織中SOD活力(U/mgprot)=SOD抑制率/ (50 %×蛋白濃度)×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果

2.1胸主動脈病理變化HE染色觀察各組小鼠動脈血管內(nèi)皮形態(tài)，結(jié)果如圖1所示，對照組(圖1A)內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整；AS組(圖1B)與NC-miRNA組(圖1C)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜增生，可見明顯的斑塊形成；miR-17-5p抑制劑組(圖1D)的小鼠病變程度有所減輕。

2.2胸主動脈細(xì)胞凋亡情況TUNEL染色觀察各組小鼠動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖2所示，對照組(圖2A)細(xì)胞排列整齊，凋亡細(xì)胞少，而AS組(圖2B)與NC miRNA組(圖2C)凋亡細(xì)胞增多，細(xì)胞排列紊亂，核固縮，棕黃色顆粒增加；miR-17-5p抑制劑組(圖2D)的小鼠凋亡細(xì)胞明顯減少，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊。

2.3動脈血管組織中凋亡因子的表達(dá)本研究利用Western blot檢測了動脈粥樣硬化過程中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)的變化，結(jié)果如圖3所示，AS組、NC-miRNA組Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)量升高(P<0.01)，而Bcl-2表達(dá)量下降(P<0.01)。而antagomiR-17-5p與NC-miRNA組相比，Bax、cleaved caspase-3和cleaved-PARP的表達(dá)量下降(P<0.01)，Bcl-2的表達(dá)量上升(P<0.01)。

圖1 動脈血管組織病理變化 HE×400

圖2 動脈血管組織細(xì)胞凋亡情況 TUNEL染色×400

圖3 Western blot檢測BCL-2、Bax、Cleaved-caspase-3以及cleaved-PARP表達(dá)水平

2.4血管炎癥因子表達(dá)變化通過ELISA檢測各組小鼠動脈血管樣本中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-10水平，結(jié)果如圖4所示，與對照組相比，AS組的TNF-α(352.30±90.00) ng/g prot、IL-6(131.34±31.99) ng/g prot水平顯著升高(P<0.01)，而IL-10(24.63±7.46) ng/g prot的水平下降(P<0.01)，NC組與AS組趨勢相同。antagomiR-17-5p處理組TNF-α(184.87±54.60) ng/g prot和IL-6(75.81±19.52) ng/g prot水平顯著低于NC-miRNA組(P<0.01)，而IL-10(56.43±18.54) ng/g prot的水平高于NC-miRNA組(P<0.01)。TNF-α、IL-6、IL-10組間比較的F值分別為34.111、31.249、71.514。

圖4 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-10在動脈血管組織中的水平

與NC組比較：**P<0.01；與NC-miRNA組比較：##P<0.01

圖5 各組小鼠動脈血管組織中MDA含量和MPO、SOD活性測定

2.5miR-17-5p對動脈粥樣硬化過程中氧化應(yīng)激的影響本研究分別檢測了動脈血管組織中MDA的含量以及SOD、MPO的活性變化，結(jié)果如圖5所示，AS組小鼠動脈血管組織中MDA含量(3.39±0.70) nmol/mg prot以及MPO的活性(3.461±0.927) U/g組織濕重升高(P<0.01)，SOD活性(10.19±2.34) U/mg prot降低(P<0.01)。antagomiR-17-5p處理降低了AS小鼠動脈血管組織中的MDA含量(2.55±0.54) nmol/mg prot與MPO活性(2.235±0.625) U/g組織濕重(P<0.01)，提高了SOD活性(21.52±3.76) U/mg prot(P<0.01)。MDA、MPO、SOD組間比較的F值分別為13.336、20.009、34.495。

3 討論

AS是一種慢性炎性疾病，炎癥反應(yīng)貫穿了AS的整個發(fā)展過程。與典型的自限性急性炎癥不同，AS不具有自限性，缺乏從促炎到抗炎的轉(zhuǎn)換。由于白細(xì)胞在AS過程中的持續(xù)積累[6]，巨噬細(xì)胞M1/M2極化不平衡[7]，受損細(xì)胞清除功能下降等[8]原因，炎癥細(xì)胞和炎癥因子持續(xù)存在，進(jìn)而導(dǎo)致慢性組織損傷。AS發(fā)展過程中，巨噬細(xì)胞的功能十分關(guān)鍵，M1型巨噬細(xì)胞與斑塊的不穩(wěn)定性相關(guān)，促進(jìn)AS發(fā)展，而M2型巨噬細(xì)胞是抗炎癥表型，促進(jìn)炎癥消退。研究[9]表明，IL-10、IL-13等細(xì)胞因子促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型向M2型轉(zhuǎn)化。Th1細(xì)胞能夠分泌INF-γ、TNF-α等細(xì)胞因子介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化[10]，同時TNF-α還能夠通過活化NF-κB通路進(jìn)一步刺激炎性細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)炎癥發(fā)展[11]。

機(jī)體在代謝過程中會產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen, ROS)，包括氧自由基、過氧化氫等。正常情況下體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)可以清除過量的ROS，一旦抗氧化系統(tǒng)與ROS之間平衡被破壞，過量的ROS會對機(jī)體造成一定的氧化損傷。ROS能夠引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡，影響內(nèi)皮細(xì)胞功能[12]，同時，內(nèi)皮下間隙中的LDL可以被氧化修飾形成oxLDL，oxLDL被巨噬細(xì)胞吞噬，最后形成泡沫細(xì)胞。oxLDL還可以結(jié)合細(xì)胞表面受體LOX-1[13]，促進(jìn)NF-κB通路活化和炎癥發(fā)展[14]。

有研究[15]曾報道了miR-17-5p的表達(dá)影響內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，因此，本研究探討了miR-17-5p在AS發(fā)展中對炎癥因子表達(dá)和氧化應(yīng)激的影響。對AS模型大鼠尾靜脈注射miR-17-5p拮抗劑，胸主動脈血管的HE染色結(jié)果顯示抑制miR-17-5p可以明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞損傷，表明miR-17-5p與AS發(fā)展具有相關(guān)性，抑制miR-17-5p可以緩解AS。TUNEL染色的結(jié)果顯示抑制miR-17-5p減少了主動脈細(xì)胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白的Western blot檢測也支持了這一結(jié)果，抑制miR-17-5p后，與促凋亡相關(guān)的蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表達(dá)量下降，抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)量上升。抑制miR-17-5p的作用后，AS小鼠動脈血管組織中炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-6水平降低，IL-10水平升高，同時MDA含量及MPO活性受到抑制，SOD活性上調(diào)，說明抑制miR-17-5p減輕了AS小鼠動脈血管組織中的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激水平，通過下調(diào)促炎因子表達(dá)，上調(diào)抗炎因子表達(dá)，可能進(jìn)一步影響巨噬細(xì)胞極化、血小板聚集等過程，減輕組織炎癥水平；另一方面，上調(diào)SOD活性可以清除過量的ROS，減少脂質(zhì)氧化和泡沫細(xì)胞形成等，最終緩解AS的病程。本研究的結(jié)果顯示出miR-17-5p作為靶點(diǎn)在治療AS中的應(yīng)用潛力。

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