普伐他汀鈉對(duì)LPS誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞NE釋放及活性的影響

陳雨虹，戴 敏，梅曉冬

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)是一種存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的絲氨酸蛋白酶，基因結(jié)構(gòu)為ELA2,是在19號(hào)染色體短臂末端區(qū)域內(nèi)含50個(gè)堿基的片段，含有218種氨基酸和4個(gè)二硫鍵，是絲氨酸蛋白酶家族的一份子。當(dāng)中性粒細(xì)胞暴露于各種細(xì)胞因子和趨化因子刺激下時(shí)可釋放NE，如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素IL-8、C5a、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和來自細(xì)菌壁FMLP的三肽[1]。

他汀類藥物是羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，是有效的降脂藥物，目前廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療。但近年來許多研究[2]顯示，他汀類藥物還具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗炎效用。他汀類藥物的多效性引起廣泛的關(guān)注。他汀藥物抗炎效用的機(jī)制具體包括有抗金屬蛋白酶作用、抗氧化作用、抗炎癥作用、抑制黏附分子表達(dá)、降低C反應(yīng)蛋白水平等。其中蛋白水解酶的過度活化，是組織器官損傷的一條重要因素，包括組織蛋白酶，NE和金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)， Kamio et al[3]研究發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可以通過HMG-CoA還原酶途徑抑制成纖維細(xì)胞釋放MMP，參與細(xì)胞炎癥過程。但目前尚無他汀類藥物是否能抑制人NE活化和過量釋放的相關(guān)作用研究。該研究在體外以LPS刺激中性粒細(xì)胞釋放NE，加入普伐他汀鈉進(jìn)行干預(yù)，了解普伐他汀鈉是否可以抑制NE的釋放，為他汀類藥物多方面應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑TBD淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)蠊?；RPMI-1640培養(yǎng)基和雙抗(美國(guó)Hyclone公司 )；D-Hanks液、紅細(xì)胞裂解液、DMSO、HEPES(北京索萊寶公司)；胎牛血清(天津康源公司)；Trueline 24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；LPS、普伐他汀鈉、Brij、純化NE(美國(guó)sigma公司)；POX染液、瑞氏-姬薩姆復(fù)合染液(臺(tái)灣BASO公司)；髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)測(cè)試盒(南京建成生物公司)；Methoxysuccinyl-alanyl-alanyl-prolyl-valyl paranitroanilide (MEOSAAPVNA)(美國(guó)SANTA公司)；人PMN Elastase ELISA試劑盒(美國(guó)Abcam公司)；紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1人外周血中性粒細(xì)胞提取、培養(yǎng)及分組處理 采用Ficoll密度梯度離心法[4]分離培養(yǎng)人外周血中性粒細(xì)胞：取健康人群體檢靜脈全血4 ml(體檢人群年齡段為18～60周歲，血標(biāo)本常溫放置不超過4 h，EDTA抗凝，血液標(biāo)本由安徽省立醫(yī)院檢驗(yàn)科提供)。取滅菌15 ml離心管，加入4 ml淋巴細(xì)胞分離液，在分離液上層緩慢加入全血標(biāo)本，放入離心機(jī)，24 ℃、1 650 r/min ，離心25 min。離心后取出，此時(shí)離心管內(nèi)液體分4層，從上往下分別是血漿層、淋巴細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層，其中中性粒細(xì)胞在管底。小心吸去上面三層，加入紅細(xì)胞裂解液。混勻，然后離心管置于冰盒中裂解15 min，期間需搖動(dòng)混勻2次。然后1 500 r/min 離心10 min，取出后吸去上清液，不破壞管底沉淀。再加入紅細(xì)胞裂解液重復(fù)裂紅4次，1 000 r/min離心5 min，直至沉淀無可見紅色。加入D-Hanks液重懸洗滌，放入離心機(jī)1 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次離心。棄上清液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基)，吹打混勻，取10 μl細(xì)胞混勻液加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，記錄細(xì)胞總數(shù)。稀釋細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/ml接種于24孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱，恒溫37 ℃，孵育48 h。實(shí)驗(yàn)分組：普伐他汀鈉組(0.5 mmol/L普伐他汀鈉)；普伐他汀鈉+LPS組(0.5 mmol/L普伐他汀鈉+1 mg/L LPS)；LPS組(1 mg/L LPS)；正常對(duì)照組(未加藥)。普伐他汀鈉和LPS均為每孔各0.2 ml，細(xì)胞鋪板時(shí)加入。

1.2.2瑞氏染色法鑒定中性粒細(xì)胞 參考血涂片瑞氏染色法進(jìn)行改良，按上述方法提取中性粒細(xì)胞，D-Hanks液重懸后，吸取一滴細(xì)胞懸液滴片，自然晾干后甲醇固定液一滴覆蓋，晾干后染色：晾干玻片上加瑞氏姬薩姆復(fù)合染液15～20滴覆蓋玻片，10 s后加水稀釋染液，染液和水比例為1 ∶3，混勻，定時(shí)3 min，細(xì)流水沖洗，晾干，油鏡下觀察。

1.2.3MPO活性檢測(cè) 采用比色法測(cè)定MPO活性(南京建成生物公司)，按試劑盒說明書提取細(xì)胞上清液樣本，按比例稀釋檢測(cè)。測(cè)定原理：中性粒細(xì)胞為終末細(xì)胞，體外培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞不斷死亡裂解，過氧化物酶顆粒釋放入細(xì)胞上清液，取細(xì)胞培養(yǎng)液離心后取上清液稀釋，加入H2O2，充分混勻后37 ℃水浴30 min，再加入AH2，通過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測(cè)定產(chǎn)物吸光度，從而推算出MPO的活力及H2O2減少的量和白細(xì)胞的數(shù)目。

1.2.4NE活性檢測(cè) 參照Betsuyaku et al[5]的實(shí)驗(yàn)方法，采用比色法測(cè)定各組上清液中NE的活性。MEOSAAPVNA是NE的一種敏感性的合成底物。準(zhǔn)備一個(gè)96孔板，加入0.1 ml底物溶液和0.08 ml的樣本，底物溶液配比：0.2 mmol/L的MEOSAAPVNA，0.1 mol/L的HEPES，0.5 mol/L的NaCl，0.1%的Brij和2%的DMSO，溶液pH值調(diào)至7.5。以純化的彈性蛋白酶標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣本稀釋后加入已鋪好底物溶液的96孔板中，室溫(25 ℃)孵育2 h，酶標(biāo)儀設(shè)定405 nm處檢測(cè)各孔吸光度，根據(jù)NE不同濃度梯度繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線推算出樣本中NE活性水平。

1.2.5ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NE含量 按人PMN Elastase ELISA試劑盒說明書操作，細(xì)胞培養(yǎng)液從24孔板中提取后離心去除細(xì)胞沉淀，取上清液，按說明稀釋，試劑盒所有溶液平衡至室溫，洗板2次，加入0.1 ml標(biāo)準(zhǔn)品和樣本，膠粘劑薄膜覆蓋，室溫25 ℃孵化1 h(振蕩器混勻)，再洗板4次，加入HRP Conjugated Antibody 繼續(xù)孵育1 h，去蓋洗4次，加入TMB Substrate Solution，避光孵育20 min，酶標(biāo)儀620 nm處檢測(cè)最高標(biāo)準(zhǔn)品OD值為0.9～0.95時(shí)，立刻加入終止液停止反應(yīng)。450 nm處檢測(cè)吸光度值。使用四參數(shù)擬合法結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線值推算樣本濃度值。

2 結(jié)果

2.1瑞氏染色結(jié)果成功提取純化人外周血中性粒細(xì)胞，改良瑞氏染色后，鏡下觀察均為多形核白細(xì)胞，核深染深紫色，胞質(zhì)淡粉紅色，均可見顆粒狀物質(zhì)。見圖1。

圖1 中性粒細(xì)胞提取后瑞氏染色 ×400

2.2LPS刺激中性粒細(xì)胞釋放MPO外周血中性粒細(xì)胞為終末細(xì)胞，從骨髓釋放入血后停留6～8 h，隨后進(jìn)入組織可存活3～5 d，為研究證實(shí)LPS刺激中性粒細(xì)胞釋放MPO顆粒的作用，實(shí)驗(yàn)以1 mg/L的LPS刺激體外培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞[6]，在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)MPO水平變化，結(jié)果顯示：LPS在體外可以刺激中性粒細(xì)胞釋放MPO。與正常對(duì)照組相比，LPS組在作用48 h后對(duì)細(xì)胞中MPO水平刺激達(dá)到最大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.55，P<0.01)。未加藥的正常對(duì)照組MPO水平隨時(shí)間增加逐漸上升，符合細(xì)胞自然死亡裂解趨勢(shì)。LPS組在48 h前MPO逐漸上升，之后下降，可能由藥物起效時(shí)間導(dǎo)致，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中的LPS組選用1 mg/L的LPS作用48 h。見圖2。

圖2 LPS刺激后細(xì)胞上清中MPO活力比較

2.3普伐他汀鈉對(duì)MPO活性的影響根據(jù)以上2.1中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以1 mg/L的LPS刺激細(xì)胞48 h作為對(duì)照組，同時(shí)加入不同濃度的普伐他汀鈉(0.1、0.5、1、2 mmol/L)進(jìn)行干預(yù)，以同樣方法測(cè)定上清液中MPO活性。檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，普伐他汀鈉在濃度為0.5 mmol/L時(shí)對(duì)MPO活性抑制作用最大，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.34，P<0.01)。見圖3。

圖3 不同濃度普伐他汀鈉對(duì)MPO活性的影響

A：對(duì)照組；B：普伐他汀鈉0.1 mmol/L組；C：普伐他汀鈉0.5 mmol/L組；D：普伐他汀鈉1 mmol/L；E：普伐他汀鈉2 mmol/L組；與對(duì)照組比較：**P<0.01

2.4普伐他汀鈉對(duì)NE活性和含量的影響根據(jù)2.1和2.2測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞分4組處理：普伐他汀鈉組；普伐他汀鈉+LPS組；LPS組；正常對(duì)照組。普伐他汀鈉和LPS均為每孔各0.2 ml，細(xì)胞鋪板時(shí)加入。比色法和ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NE活性及含量，跟正常對(duì)照組相比，LPS組NE活性和含量都明顯升高，加入普伐他汀鈉后明顯降低，單獨(dú)加入普伐他汀鈉組也可顯著降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(NE活性：F=60.910，P<0.01；NE含量：F=118.354，P<0.01)。NE活性及含量在4個(gè)處理組中降低和升高的趨勢(shì)大致相同。見圖4。

圖4 NE含量及活性表達(dá)

A：普伐他汀鈉組；B：普伐他汀鈉+LPS 組；C：LPS 組；D：正常對(duì)照組；與正常對(duì)照組比較：**P<0.01；與LPS組比較：△△P<0.01

3 討論

中性粒細(xì)胞是參與慢性氣道炎癥反應(yīng)的最主要的細(xì)胞之一，可通過釋放蛋白酶等多種活性物質(zhì)直接或間接損傷氣道組織[7]。MPO主要存在于中性粒細(xì)胞中，是嗜中性粒細(xì)胞中嗜天青顆粒釋放的標(biāo)志酶，其含量多少與中性粒細(xì)胞的數(shù)目成正比[8]。中性粒細(xì)胞活化后釋放MPO，在肺組織及外周血中均可檢測(cè)到MPO活性顯著增高。因此MPO的相關(guān)檢測(cè)可以反應(yīng)出中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒的釋放水平。NE主要由中性粒細(xì)胞中嗜天青顆粒釋放，此外還有巨噬細(xì)胞、少量的單核細(xì)胞和T細(xì)胞也可釋放NE。中性粒細(xì)胞中NE濃度可超過5 mmol/L，每個(gè)成熟粒細(xì)胞中大約含有400個(gè)陽(yáng)性顆粒[9]。NE具有強(qiáng)效的殺菌活性，并且可以協(xié)助活化的中性粒細(xì)胞吞噬病原體。此外，NE可以間接促進(jìn)上皮細(xì)胞釋放有效的抗蛋白酶抗菌劑如彈力素(Elafin)，SLPI和人β-防御素-2的表達(dá)幫助宿主消滅病原體[10]。然而，中性粒細(xì)胞又是一把雙刃劍，中性粒細(xì)胞釋放NE與多種炎癥性疾病有關(guān)，中性粒細(xì)胞在脫離循環(huán)后不會(huì)存活很久，然而在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary，COPD)等患者長(zhǎng)期慢性的肺部炎癥刺激下可以延長(zhǎng)其在肺組織中的存活時(shí)間。過高濃度的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的釋放和IL-10的相對(duì)缺乏，可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，而NE能特異性地破壞巨噬細(xì)胞吞噬凋亡中性粒細(xì)胞的功能，導(dǎo)致大量凋亡中性粒細(xì)胞壞死釋放更多NE及有害物質(zhì)進(jìn)入肺組織[11]。此外，NE還可以誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白的生產(chǎn)及杯狀細(xì)胞化生，造成氣道黏液高分泌狀態(tài)，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供有利條件。

通過對(duì)COPD患者各種炎癥標(biāo)志物的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，由中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的MMP和NE與COPD炎癥作用機(jī)制密切相關(guān)，這兩種酶不僅影響蛋白酶水解，而且能持續(xù)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[12]。在COPD患者氣道、肺泡灌洗液、誘導(dǎo)痰及外周血中均可以檢測(cè)到MMP和NE水平有不同程度的升高。研究[13]證實(shí)COPD患者急性期血清NE水平顯著升高，NE的表達(dá)與COPD的臨床分期有關(guān),急性加重期NE水平高于穩(wěn)定期,且與COPD的臨床分級(jí)有關(guān)。COPD患者每一次急性加重，都離不開肺部感染這個(gè)重要因素，炎癥細(xì)胞大量募集，細(xì)胞炎癥因子及組織蛋白酶的大量釋放均導(dǎo)致肺氣腫呈進(jìn)行性加重，且肺泡組織結(jié)構(gòu)破壞后是不可逆的，在此過程中，NE扮演了一個(gè)重要的角色。因此降低COPD患者NE水平對(duì)于改善氣道重塑，延緩肺氣腫進(jìn)展有非常重要的意義。

目前他汀類藥物對(duì)COPD患者的療效意見尚不統(tǒng)一，Criner et al[14]通過一項(xiàng)大型前瞻性、多中心、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)研究證明辛伐他汀對(duì)中度及重度COPD急性加重頻率沒有影響，而Raymakers et al[15]的一項(xiàng)基于人群的隊(duì)列研究調(diào)查了他汀類藥物的使用或可降低COPD患者全因死亡率和肺相關(guān)死亡率，同時(shí)有相關(guān)回顧性研究[16]表明他汀類藥物可降低COPD惡化率和嚴(yán)重程度，減少患者住院率和死亡率。目前各類研究對(duì)COPD療效評(píng)價(jià)的指標(biāo)不同，COPD是一種慢性疾病，多數(shù)還伴有全身炎癥反應(yīng)及其他系統(tǒng)疾病，臨床研究中有無法避免的干擾因素存在，且在不同研究中患者入選標(biāo)準(zhǔn)及他汀類藥物作為COPD輔助用藥的療程及劑量不同，這些都有可能是研究結(jié)果出現(xiàn)分歧的原因。而許多動(dòng)物模型及體外實(shí)驗(yàn)受到的干擾較小，因此可以從多方面證實(shí)他汀藥物的多效性。

本研究結(jié)果顯示，LPS可以刺激體外培養(yǎng)的中性粒細(xì)胞釋放胞內(nèi)嗜天青顆粒，檢測(cè)上清液中MPO及NE水平隨之升高，而加入普伐他汀鈉可以顯著降低MPO及NE水平，從抗蛋白酶作用的方面提示了他汀藥物的又一條效用，為他汀類藥物或可應(yīng)用于COPD輔助治療，改善患者預(yù)后提供了新的依據(jù)。但體外細(xì)胞水平研究有局限性，未能結(jié)合組織病理及臨床病例證實(shí)研究結(jié)論，有待在今后的研究中進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)對(duì)象及方法進(jìn)行深入探索。

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