亮菌多糖對GES-1細胞發生EMT的影響及機制研究

趙莉莉，朱耀東，李 平,張 梅

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細胞轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，在胚胎發育、傷口愈合、組織再生、器官纖維化和腫瘤進展中起重要作用[1]。研究[2]表明 ，EMT與胃癌的發生發展息息相關，廣泛存在于胃癌前病變過程中，與多種信號通路及基因表達失調有關，其主要表現為細胞形態學變化及相關蛋白異常表達，胃黏膜上皮細胞由不規則多邊形向梭形轉變，細胞之間黏連減少，排列紊亂；其標記上皮細胞的E-鈣黏蛋白(E-Cadherin)表達減少，標記間質細胞的N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達增多。亮菌多糖(Armillariellatabescenspolysaccharides,ATPS)是亮菌生長代謝過程中的有效產物，是亮菌口服液的有效成分，ATPS有明顯的增強機體免疫力、抗腫瘤及保護胃黏膜的作用[3]。亮菌口服液臨床廣泛用于治療慢性淺表性、萎縮性胃炎，并取得了較好的療效，有效的逆轉胃癌前病變，控制了疾病的進展。關于亮菌多糖對人胃黏膜細胞(human gastric epithelial cell line, GES-1)發生EMT的影響及相關機制研究，相關研究報道較少。該研究利用白介素-8(interleukin-8，IL-8)誘導GES-1細胞建立EMT模型；不同劑量亮菌多糖作用后細胞形態可部分恢復，侵襲力降低。

1 材料與方法

1.1實驗儀器細胞培養箱購自美國Thermo公司；安全生物柜購自北京Aertai公司；DMEM培養基、胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自以色列Biological Industries公司；ATPS購自合肥誠志生物制藥有限公司(純度>90%)；IL-8及IL-8溶解套裝購自美國Peprotech公司，溶解稀釋成25 mg/L，分裝后-20 ℃保存；兔抗人E-Cadherin、N-cadherin、Vimentin、PDCD4抗體購自美國Cell Signaling Technology生物公司；鼠抗人GAPDH抗體購自上海BBI life sciences公司；二抗購自美國Promega公司；二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、細胞裂解液購自合肥biosharp公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 人胃黏膜上皮細胞GES-1株購自南京科佰生物科技有限公司，在細胞培養室的超凈工作臺上，將GES-1細胞置于DMEM培養液中(含10%胎牛血清,1%雙抗 )，將培養皿置于培養箱中37 ℃、5% CO2培養。當培養皿中細胞生長近80%細胞基本融合時，用濃度為0.25% 胰蛋白酶37 ℃、5% CO2培養箱內消化2～3 min，顯微鏡下觀察到細胞變圓、散開時，1 ∶1加入DMEM培養液終止消化，800 r/min離心3 min，重懸后分裝至3小皿繼續培養。

1.2.2建立EMT模型 生長至對數期的GES-1細胞，加入含10% FBS的DMEM完全培養基在37 ℃、5% CO2的條件下培養12 h，待細胞完全貼壁，更換培養基為1%FBS的DMEM，分別加入濃度為25、50、100、200、300 μg/L的IL-8作為實驗組；對照組更換正常培養基,繼續培養24 h。

1.2.3MTT法檢測不同濃度亮菌多糖對GES-1細胞增殖的影響 取對數生長的GES-1細胞消化計數后接種于96孔細胞培養板中，8.0×103個每孔，37 ℃、5% CO2溫室培養12 h細胞長成單層 ,將ATPS用DMEM稀釋成15、30、60、120、240 mg/L分別加入各孔中,每孔0.1 ml,每一稀釋度設置5個復孔 ,同時設立空白對照組、DMSO處理組及僅加DMSO組。37 ℃、5% CO2溫育24 h后每孔加入MTT(5 g/L)10 μl后繼續孵育4 h，小心吸凈各孔內培養液，然后每孔內加入150 ml DMSO，震蕩10 min，酶標儀測其波長490 nm吸光度，各組均取平均值，計算各組細胞的相對存活率并繪制柱狀圖。以空白組為零，抑制率(%)=1-(給藥組OD值-DMSO組OD值)/(空白組OD值-DMSO組OD值)×100%，實驗重復3遍。

1.2.4亮菌多糖對IL-8誘導的GES-1細胞發生EMT的影響 GES-1細胞隨機分為5組，每組至少3復孔。分別設空白對照組、模型組、實驗組[ATPS(高、中、低劑量)組]。待細胞貼壁后除空白對照組外，其余各組預先更換為1% FBS的DMEM并給予IL-8 200 μg/L孵育1 h后，實驗組給予不同濃度(30、60、120 mg/L)的亮菌多糖繼續孵育24 h。

1.2.5光學顯微鏡觀察細胞形態變化 取不同濃度IL-8誘導24 h后的GES-1細胞顯微鏡下拍照，每孔取4個視野；同樣的方法對亮菌多糖處理后的各組細胞在光學顯微鏡下拍照。

1.2.6細胞劃痕實驗 先用記號筆在6孔板背后用直尺均勻劃橫線，每孔至少穿過5條線，將對數期生長的GES-1細胞胰蛋白酶消化、10% MDEM重懸，每孔內加入約8×105個細胞，以過夜能鋪滿孔底為最好，37 ℃、5% CO2的條件下培養待細胞至細胞融合達到90%以上，用100 μl移液槍頭在孔板內平行劃痕，PBS液洗滌3次后，空白對照組加入1% FBS的DMEM培養基1.5 ml，模型組加入IL-8 200 μg/L含1% FBS的DMEM培養基1.5 ml，實驗組加入IL-8 200 μg/L含1%FBS的DMEM培養基1.5 ml培養1 h后加入ATPS 120 mg/L,在倒置顯微鏡100倍下觀察、劃痕兩側細胞的遷移情況，放入37 ℃、5% CO2培養箱內培養，分別于0、6、12、18、24 h鏡下拍照測量劃痕寬度，比較各組間劃痕愈合的差異,實驗重復3次。

1.2.7Western blot法檢測EMT相關蛋白及PDCD4蛋白的表達 將處理后細胞棄上清液，加入細胞裂解液(80～100 μl)，充分搔刮孔底后收集樣本，沸水煮樣10 min，-20 ℃凍存備用。5%濃縮膠，10%分離膠，每孔上樣10 μl，90 V恒壓電泳20 min，調整電壓150 V電泳60 min；恒流350 mA轉膜150 min，將蛋白轉至NC膜上；用50 mg/L的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4 ℃ 孵化過夜，E-Cadherin(1:300)、N-cadherin(1 ∶500)、Vimentin(1 ∶500)、PDCD4(1 ∶500)、GAPDH(1 ∶1 000)，TBST洗去一抗(共洗5次,每次7 min)，加二抗(1 ∶10 000)室溫孵化1h，TBST洗去二抗(共洗5次,每次7 min)，ECL發光試劑A液：B液1 ∶1混合后均勻滴在條帶上，使用ImageQuant LAS 4000系統顯影，Image-Pro-Plus軟件進行Western blot條帶灰度值分析。

2 結果

2.1觀察EMT模型細胞形態變化IL-8誘導24 h后，GES-1細胞形態由不規則多邊形、易聚集成片向梭形轉變，細胞排列疏松紊亂，細胞間粘連度減小，隨IL-8濃度越大，細胞形態變化越明顯，見圖1。

2.2Westernblot法檢測IL-8誘導的GES-1細胞EMT相關蛋白表達變化結果顯示，其標記上皮細胞的E-Cadherin表達減少，標記間質細胞的N-cadherin、Vimentin表達增多，綜合3種蛋白表達量變化情況及結合形態學變化，選擇IL-8 200 μg/L誘導建立EMT模型，見圖2。

圖1 IL-8誘導GES-1發生EMT轉變細胞形態的變化 ×100

圖2 Western blot法檢測各組細胞中E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin的表達

1:空白對照組；2：IL-8 25 μg/L；3：IL-8 50 μg/L；4：IL-8 100 μg/L； 5：IL-8 200 μg/L；6：IL-8 300 μg/L ；與空白對照組比較：*P<0.05，***P<0.001

2.3MTT檢測ATPS對GES-1細胞存活率的影響不同濃度ATPS處理GES-1細胞24 、48 h后，相同作用時間不同濃度之間用χ2檢驗，相同濃度不同作用時間組間行t檢驗。MTT結果提示：同一濃度下，隨著藥物作用時間增加，對細胞的抑制作用增強，差別有統計學意義；同一時間點，ATPS濃度的增加對GES-1細胞增殖的抑制作用的差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4觀察ATPS逆轉GES-1細胞EMT后細胞形態的變化和空白對照組相比，模型組GES-1細胞形態明顯由多邊形向梭形轉表，細胞排列疏松紊亂，細胞間粘附力降低，實驗組和模型組比較，細胞形態向多邊形轉變，細胞之間出現片狀粘連，生長狀態好轉，見圖4。

2.5ATPS逆轉GES-1細胞發生EMT相關蛋白表達變化Western blot結果顯示實驗組與模型組相比上皮細胞的E-Cadherin表達增加，標記間質細胞的N-cadherin、Vimentin表達減少，見圖5。

圖3 不同濃度ATPS用于GES-1細胞的存活率

與處理48 h組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4 不同濃度ATPS逆轉IL-8誘導的GES-1細胞發生EMT的細胞形態變化 ×100

圖5 Western blot法檢測ATPS作用前后EMT相關蛋白變化

1:空白對照組；2：IL-8 200 μg/L；3：IL-8 200 μg/L +ATPS 30 mg/L；4:IL-8 200 μg/L +ATPS 60 mg/L；5: IL-8 200 μg/L +ATPS 120 mg/L；與IL-8 200 μg/L比較：*P<0.05

2.6ATPS逆轉GES-1細胞發生EMT的機制探討為進一步探討可能機制，Western blot檢測程序性細胞死亡因子PDCD4蛋白表達量，結果顯示，模型組PDCD4表達明顯減少，加入亮菌多糖后，PDCD4表達量增高，說明亮菌多糖逆轉EMT可能與調節PDCD4表達量有關,見圖6。

2.7細胞劃痕實驗結果細胞劃痕實驗顯示IL-8使GES-1細胞侵襲擴散能力增強，而ATPS可以顯著抑制GES-1細胞向周圍擴散，抑制其侵襲和轉移能力,見圖7。

3 討論

圖6 Western blot法檢測程序性細胞死亡因子PDCD4蛋白表達量

1:空白對照組；2：IL-8 200 μg/L；3:IL-8 200 μg/L +ATPS 30 mg/L；4:IL-8 200 μg/L +ATPS 60 mg/L；5:IL-8 200 μg/L +ATPS 120 mg/L；與IL-8 200 μg/L比較：***P<0.001

圖7 細胞劃痕實驗不同時間各組細胞向周圍擴散的程度

亮菌又叫假蜜環菌，是一種兼食用與藥用價值于一體的名貴真菌，從2002年開始亮菌口服液應用于臨床，主要用于慢性肝炎、遷延性肝炎、慢性膽管炎和膽囊炎以及慢性、淺表性、萎縮性胃炎及放療、化療引起的白細胞減少的輔助治療，取得顯著的療效。亮菌可降低化療后大鼠胃腸道組織5-HT的釋放,可有效抑制順鉑化療所誘發的胃節律性運動紊亂[4]。以亮菌發酵產物為主要成分的亮菌口服液臨床上長期應用于慢性胃炎的治療，取得顯著的療效，可以有效逆轉慢性萎縮性胃炎，研究[5]表明，亮菌口服液對反流液造成的胃黏膜損失有保護作用，其機制可能與降低了胃黏膜COX-2含量相關，并且亮菌口服液可以通過修復受損胃黏膜的超微結構來起到保護作用[6]。大量臨床案例及實驗室研究表明慢性萎縮性胃炎屬胃癌前病變，亮菌口服液可有效逆轉胃癌前病變，降低胃癌的發生。其中亮菌口服液的主要有效成分ATPS起到重要的作用，亮菌多糖是由亮菌發酵產生的分子量145 000的雜多糖，由L-木糖、L-巖藻糖、D -半乳糖、D -葡萄糖和D -甘露糖5種單糖組成。研究[7]表明，亮菌多糖可通過提高小鼠腸黏膜組織中表皮生長因子EGF含量降低前列腺素2含量，從而對順鉑所致小鼠小腸黏膜損傷起到保護作用。亮菌多糖作為一種天然藥物對人類的多種疾病療效明顯，多年以來，由于其分離純化困難，分子結構不明確等各種因素限制了其發展和應用，本課題組與合肥誠志生物制藥有限公司合作，提取了純度較為可觀的亮菌多糖，用于亮菌多糖在逆轉胃癌前病變的過程作用的研究。

既往研究認為胃癌的發病與家族史、不良生活習慣、H.pylori感染、相關藥物使用不當以及人體免疫功能下降等因素密切相關。且胃癌的發生是一個慢性演變的過程，胃黏膜在各種因素的刺激下，從正常胃黏膜-淺表性胃炎-慢性萎縮性胃炎-腸上皮化生-異性增生逐步發展成胃癌，因此如何將胃癌抑制在發展階段，如何有效逆轉胃癌前病變成為亟待解決且意義重大的事情。隨著分子生物學的不斷發展，研究者開始從分子水平上進一步探尋胃癌前病變的發病及癌變機制。研究表明，在胃癌前病變的形成過程中，DNA甲基化，微衛星不穩定性，端粒酶激活，EMT的發生等占有重要的地位[8]，其中EMT與胃癌前病變的形成過程密切相關，在胃癌發生、發展過程中發揮關鍵性作用[2]。

本研究表明，亮菌多糖可逆轉IL-8誘導的GES-1細胞EMT的發生，不僅從形態學上使其恢復上皮細胞的不規則多邊形，其EMT相關蛋白E-Cadherin、N-cadherin、Vimentin表達均得到逆轉，細胞劃痕實驗證明，亮菌多糖可有效抑制GES-1細胞的擴散侵襲能力，這可能與上皮細胞因子E-Cadherin表達增多有關，E-Cadherin使細胞間相互粘附聚集，不易向遠處擴散，連續觀察24 h，實驗組較模型組細胞擴散程度明顯減低，本研究表明亮菌多糖可通過逆轉EMT對胃癌前病變起治療作用，且可以抑制GES-1細胞的擴散侵襲，阻止癌變進程。PDCD4作為一種新近發現的抑癌基因在多種腫瘤的發生發展中發揮重要的作用，Yu et al[9]在胃癌細胞株GSC-7901和BGC-823中轉染入過表達PDCD4的質粒，使PDCD4 mRNA及蛋白均高表達，然后檢測EMT特異性標志物TWIST1、Vimentin、E-Cadherin，結果顯示間質細胞標志物TWIST1、Vimentin蛋白及相應mRNA均降低，而上皮細胞標志物E-Cadherin明顯升高，表明PDCD4可逆轉EMT，本研究為了進一步研究亮菌多糖逆轉EMT可能機制，Western blot檢測PDCD4蛋白的表達變化，結果顯示IL-8誘導的模型組較空白對照組明顯降低，而亮菌多糖處理后PDCD4基本恢復到處理前水平，說明亮菌多糖逆轉EMT可能與使PDCD4高表達有關，PDCD4的表達受各種因素的調節。DNA甲基化可明顯抑制PDCD4的表達，Gao et al[10]使用DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷阻斷神經膠質瘤細胞中的甲基化，PDCD4基因表達明顯提高。研究[11]表明，多種微小RNA(miRNA)與PDCD4的表達相關，其中miR-21與PDCD4表達呈明顯負相關，Wen et al[12]在食管鱗狀細胞癌細胞株(TE-13)中轉染反義miR-21使其表達明顯減少，結果顯示與對照組相比轉染染反義miR-21的TE-13細胞中PDCD4表達明顯升高，且miR-21、miR-23a和miR-27a可協同抑制PDCD4、抗增殖基因2(BTG2)等抑癌基因的表達來促進胰腺導管腺癌進展，增強其侵襲力，可作為生存期較短的可靠標志[13-14]。miR-183過表達亦可使PDCD4蛋白表達降低，促進細胞增殖和轉移，在食管癌細胞中可通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)通路來降低miR-183表達，進而上調PDCD4[15]。本研究表明ATPS逆轉EMT可能與調高PDCD4表達有關，但ATPS到底是通過何種機制上調PDCD4表達仍未清楚，下一步擬在基因水平進一步探討相關機制及可能的信號表達通路。

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