SAHA聯合厄洛替尼對EGFR-TKI耐藥肺癌細胞株H1975的生長抑制作用及機制

陳立豪，郝吉慶

肺癌是發病率及死亡率最高的惡性腫瘤，全球每年約有150萬人患病，5年生存率不足20%，依據組織學分型，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer， NSCLC) 約占80%[1-2]。隨著癌癥的個體化治療及精準醫學的提出，基于腫瘤患者的驅動基因突變檢測在腫瘤診斷和治療過程中有著重要的影響。在亞裔、不吸煙、女性、腺癌患者中表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因的突變率較高，約占50%，尤其在我國EGFR突變率為30%，常為外顯子19缺失突變(del 19)及外顯子21的替換突變(L858R)[3];臨床上具有EGFR突變的患者在使用針對EGFR突變的靶向藥物如特羅凱(厄洛替尼)、易瑞沙(吉非替尼)等時，早期絕大部分患者都取得不錯的臨床效果，但在經過治療一段時間后都會無法避免地出現耐藥現象，導致治療失敗[4]。除了基因的改變與腫瘤的發生發展有著重要的關系，表觀遺傳的改變也起著重要的作用。近年來研究[5]證實，異常的DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳學的改變，在腫瘤的發展中有著至關重要的作用。組蛋白去乙?；? histone deacetylase，HDAC) 抑制劑通過抑制組蛋白及非組蛋白的去乙?；?，從而抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡等來發揮抗腫瘤作用。該研究通過體外單藥及聯合用藥對肺腺癌表皮生子因子酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)靶向耐藥細胞株H1975的增殖、侵襲影響，探討HDAC抑制劑伏立諾他 (vorinostat，SAHA)與厄洛替尼聯合對肺癌細胞是否具有協同抑制作用以及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料人肺腺癌H1975細胞株購自上海中科院細胞庫；RPMI-1640購自美國Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物科技公司；CCK-8試劑盒購自北京索萊寶科技公司；Transwell小室、Matrigel基質膠購自康寧(中國)科技有限公司；SAHA 及厄洛替尼均購自美國 Selleck 公司；Western blot化學發光劑購自美國Millipore 公司；磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(the serine-threonine kinase，AKT)、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine kinase，p-AKT)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin，mTOR)、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 H1975細胞細胞培養于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素(100 U/ml)的RPMI-1640培養液中，在 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中常規培養，細胞融合80%時進行傳代，取對數生長期細胞用于各項實驗研究。

1.2.2CCK-8 取對數生長期的細胞,以約5 000細胞每孔接種于96孔板中，培養過夜后待細胞完全貼壁后分為4組作用：① 對照組(不加藥)；② SAHA組(0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)；③ 厄洛替尼組(0.25、0.5、1、2、4、8、16 μmol/L)；④ SAHA+厄洛替尼組(SAHA 0.25 μmol/L/L+厄洛替尼 0.25μmol/L, SAHA 0.5 μmol/L+厄洛替尼0.5 μmol/L以此類推)，每組設5個復孔，藥物作用48 h后，每個孔加入10 μl CCK-8溶液，培養2 h，在酶標儀測450 nm處吸光度(absorbance，A)值，并計算細胞存活率(survival rate,SR)，試驗重復3次。細胞存活率(%)=(試驗組A/對照組A)×100%。根據實驗結果，對于后續實驗采用SAHA 3 μmol/L，厄洛替尼 19 μmol/L,SAHA( 2 μmol/L)+厄洛替尼(2 μmol/L)。

1.2.3平板克隆實驗 將對數生長期細胞，用胰酶消化后吹散成單細胞懸液，取500個每個孔接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h，細胞貼壁后，分為4組：① 對照組；② SAHA組;③ 厄洛替尼組；④ SAHA+厄洛替尼聯合用藥組。每3 d更換一次培養液至細胞集落形成，終止培養。棄培養液，PBS 液洗2次后，純甲醇固定15 min，結晶紫染色30 min，空氣干燥后，顯微鏡下計數形成的克隆數(≥50個細胞為一個克隆) ，計算各組克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆數/接種細胞數×100%。實驗重復3次。

1.2.4Transwell小室侵襲實驗 將分裝好的Matrigel膠(4 ℃)放置過夜使之溶解, 用 4 ℃預冷的無血清培養液稀釋至1 mg/ml,取稀釋的 Matrigel膠100 μl加入到Transwell小室的上室, 將鋪膠后的Transwell小室于 37 ℃溫育至少2 h, 以使凝膠形成。胰酶消化4組經過藥物作用48 h后細胞，并收集細胞, 用PBS洗滌細胞3次, 用無血清的培養液重懸細胞。取 100 μl的細胞懸液(細胞數約8 000個)加入上室,在 Transwell小室的下室加入含培養液700 μl,37 ℃培養24 h。取出上室, 用棉簽擦掉上層細胞, 加入甲醇固定 3 min, 棄固定液, 加入 0.1%結晶紫染液, 染色 20 min, 雙蒸水洗3遍, 熒光顯微鏡下拍照，隨機選取3個視野計算，取平均值，實驗重復3次。

1.2.5Western blot法 各組細胞處理48 h后收集細胞，加入預冷的RIPA 裂解液( 含PMSF及磷酸化酶抑制劑) 將細胞重懸，于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，吸取上清液行Bradford 法蛋白濃度測定，然后行SDS-PAGE 電泳，Western blot法轉移蛋白，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育2 h，應用ECL化學發光試劑盒進行顯影，電泳條帶用用掃描儀采集X線片圖像，使用Quantity One 軟件，以β-actin為內參照，對各目的條帶進行密度分析。

2 結果

2.1SAHA、Erlotinib單藥及聯合用藥對H1975細胞存活率的影響CCK8結果顯示，藥物作用48 h后，SAHA組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細胞抑制率差異有統計學意義(t=7.794、16.429、42.212、209.000、143.760，P<0.05)；Erlotinib組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細胞抑制率差異有統計學意義(t=6.379、8.220、15.057、18.187、42.500，P<0.05)；聯合用藥組(1、2、4、8、16 μmol/L)較對照組細胞抑制率差異有統計學意義(t=79.674、67.278、75.215、 71.279、108.098，P<0.05)；可見隨藥物濃度增加，藥物對細胞的抑制作用也逐漸增強，呈現濃度依賴性。SAHA和Erlotinib對H1975細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)值分別為(3.16±0.33)和(19.31±2.53)μmol/L，而聯合用藥組IC50值為(2.11±0.25)μmol/L，差異有統計學意義(F=127.299，P<0.05)，見圖1。不同濃度的SAHA聯合Erlotinib抑制劑處理H1975細胞48 h后，兩藥聯合后增殖抑制作用明顯增強，各聯合藥物劑量組的聯合指數(combination index，CI)均<1，表現出協同效應(圖2)。

2.2SAHA、Erlotinib單藥及聯合用藥對H1975腫瘤細胞的克隆形成SAHA組對細胞克隆形成率為41.90%，Erlotinib組形成率48.11%，而聯合用藥組17.89%。結果顯示聯合用藥組較單藥組能夠顯著抑制腫瘤細胞的克隆形成，差異有統計學意義(F=29.350，P<0.001)，見圖3。

2.3SAHA、厄洛替尼單藥及聯合用藥對H1975細胞侵襲能力的影響實驗結果顯示：SAHA組及Erlotinib組細胞侵襲能力較對照組降低，差異有統計學意義(t=6.072、3.838，P<0.05)；兩藥聯合組與單藥組細胞相比，細胞侵襲到Transwell 小室Matrigel 膠下面的細胞數顯著降低，差異有統計學意義(F=29.350，P<0.05)，見圖4。

圖1 SAHA、厄洛替尼單藥及聯合用藥對H1975細胞的增殖活力作用

圖2 SAHA聯合Erlotinib 對H1975細胞的聯合作用效應

圖3 SAHA、Erlotinib單藥及聯合用藥對H1975腫瘤細胞的克隆率形成

1：對照組；2：SAHA組；3：厄洛替尼組；4：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：**P<0.01；與SAHA組比較：###P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

圖4 Transwell 小室培養48 h后各組遷移到下室的細胞結晶紫染色圖 ×200

A：對照組；B：SAHA組；C：厄洛替尼組；D：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與SAHA組比較：##P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

2.4SAHA、Erlotinib單藥及聯合用藥對H1975細胞內PI3K/AKT/mTOR信號通路影響H1975細胞經過藥物處理48 h后，應用Western blot檢測研究結果顯示：PI3K蛋白表達在各處理組都有明顯降低；p-AKT蛋白表達量在SAHA組降低，而Erlotinib組無明顯改變；p-mTOR蛋白表達量在各組都降低。兩藥聯合組較其余各組PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量均明顯減低，差異具有統計學意義(F=84.198、349.523、119.197，P<0.01)，見圖5。

3 討論

肺癌由于早期癥狀不典型，大部分患者在診斷時已處于中晚期，失去手術機會?；熀桶邢蛑委熓峭砥贜SCLC患者的主要治療手段。相對于傳統化療，靶向藥物具有副反應輕、選擇性較高、耐受性好、服用方便、依從性高等特點[6]。EGFR是原癌基因HER1表達產物，為一跨細胞膜糖蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，在多種腫瘤中均可發現EGFR的高表達或異常表達。EGFR-TKI如厄洛替尼等，通過與EGFR結構域中的ATP結合位點相結合，阻斷EGFR下游信號通路的傳導，達到抑制腫瘤細胞增殖作用；還可以抑制絲裂原活化蛋白激酶的活化，促進腫瘤細胞凋亡以及抑制腫瘤細胞的血管形成。對于EGFR突變陽性患者有明顯療效，使患者無進展生存期顯著提高。但絕大部分患者都不可避免的在一年內出現耐藥，導致病情惡化。常見的耐藥機制是T790M突變(50%)、MET基因擴增(20%)等[7]，盡管臨床上對于一代靶向藥物的耐藥而開發出二代、三代靶向藥物，但是大部分患者使用一段時間后效果并不是非常理想，故對于這些EGFR-TKI治療失敗的患者該如何治療是臨床醫師比較棘手的問題。

圖5 藥物對H1975細胞PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響

1：對照組；2：SAHA組；3：厄洛替尼組；4：SAHA+厄洛替尼組；與對照組比較：**P<0.01，***P<0.001；與SAHA組比較：###P<0.001；與厄洛替尼組比較：△△△P<0.001

表觀遺傳是指基因表達或蛋白質的表達改變不涉及堿基序列的變化，但可以穩定遺傳的現象。越來越多的研究[8]表明，隨著年齡增長、外界環境刺激等因素，細胞的正常表觀遺傳狀態會被打破，導致癌基因的異常激活或抑癌基因的失活，導致腫瘤的發生、發展。表觀遺傳修飾主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA的調控、染色質重塑等[9]。近年來隨著對表觀遺傳學研究,組蛋白的異常修飾調節與腫瘤發生有密切關系；正常情況下組蛋白處于乙?；叭ヒ阴；膭討B平衡之中，乙?；芙M蛋白乙?；D移酶調控；去乙?；瘎t受HDAC的調控。在腫瘤細胞中，HDAC活性明顯增強，平衡狀態打破，使得抑癌基因表達下調的同時致癌基因表達上調[10]。

HDAC抑制劑作為一種高效低毒的靶向抗腫瘤藥物正日益引起人們的關注。 它可以通過抑制HDACs，調節組蛋白和非組蛋白的乙?；?，從而達到調控基因表達的目的，以逆轉變異細胞的表型、抑制細胞的增殖、誘導腫瘤細胞周期阻滯、分化、通過內源性和外源性途徑誘導細胞凋亡、抑制血管生成和腫瘤侵襲等[11]。SAHA是一種廣譜的組蛋白抑制劑，于2006年被FDA批準上市，用于病情惡化或病情反復者的皮膚T細胞淋巴瘤的治療。當其他藥物治療效果不佳時，該藥表現出良好的耐受性[12]。研究[13]表明，SAHA和卡鉑、紫杉醇還可聯合治療晚期非小細胞肺癌,并且SAHA在多項腫瘤的聯合化療中均顯示出其協同或增強作用。

本研究選用具有T790M突變的肺癌細胞株H1975，探討兩藥體外聯合應用對肺癌細胞的影響及作用機制，結果顯示SAHA與厄洛替尼聯合用藥具有協同作用，同單獨用藥組比較能夠顯著抑制H1975腫瘤細胞的生長增殖、克隆及侵襲能力；同時由于PI3K/AKT/mTOR信號傳導通路的過渡激活與腫瘤的增殖、侵襲轉移、抗凋亡有著重要的關系；本研究發現聯合用藥組對PI3K/AKT/mTOR信號通路有著顯著的抑制作用。

綜上所述，厄洛替尼聯合HDAC抑制劑SAHA對具有T790M突變的H1975細胞株具有良好的協同作用，可增強細胞對厄洛替尼的敏感性，為臨床上對于EGFR-TKI 獲得性耐藥患者的治療提供新的實驗室依據及治療策略。但本實驗僅為初步的體外細胞研究，尚需進一步的動物實驗及臨床試驗來驗證其在體內的有效性及安全性。

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