載氣吹掃尼古丁長期吸入對大鼠心血管功能、氧化應激和炎癥水平影響

程 攀，何 慶，張曉宇，張永學，張文欣，汪志偉，趙慶中，高 杉

尼古丁(nicotine)是一種無色的液態(tài)生物堿，最早從煙草中提取發(fā)現(xiàn)，故又名煙堿。煙堿性劇毒，小劑量可興奮呼吸中樞，升高血壓，而大劑量攝入將引起中樞神經系統(tǒng)的麻痹。研究[1]顯示尼古丁在循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)等中存在負性效應，其中對心血管功能的影響極為重要，通過損傷血管內皮，影響血脂代謝，誘發(fā)動脈粥樣硬化的形成。同時尼古丁誘導細胞膜的損傷，干擾GSH代謝循環(huán)，影響氧化-抗氧化平衡[2]。目前，在尼古丁染毒動物模型的建立、尼古丁生物學效應實驗室研究中，多采用皮下注射方法；在研究煙草危害的相關實驗中，多采用香煙燃燒、電子煙煙霧暴露法。但皮下注射法對于模擬吸煙環(huán)境的真實性很差，直接燃燒香煙法對于環(huán)境存在污染，而使用電子煙暴露法除環(huán)境污染外，成本也太高。為此，該實驗建立了載氣吹掃尼古丁吸入暴露法觀察和研究尼古丁吸入暴露對大鼠心血管功能、氧化應激狀態(tài)和炎癥水平的影響。

1 材料與方法

1.1藥物及儀器尼古丁；一氧化氮(nitric oxide, NO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒、PE聚乙烯塑料管、靜脈穿刺套管針、氣相色譜儀、BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)

1.2載氣吹掃尼古丁吸入暴露法建立該實驗結合氣象色譜-串聯(lián)質譜法(GC-MS)定性、定量分析技術，建立了載氣吹掃尼古丁吸入暴露法，該方法采用空氣氣流、氧濃度穩(wěn)定，尼古丁濃度恒定可控。本研究根據GC-MS結果，確定尼古丁吸入濃度為5.083 μg/ml，擬在該濃度下進行大鼠吸入暴露實驗。

1.3動物模型制備及分組40只雄性SD大鼠，體重(180±10)g。隨機均分為對照組、尼古丁低劑量組、尼古丁中劑量組和尼古丁高劑量組，每組10只。其中每天固定時間，低、中、高劑量尼古丁組分別暴露處理1、2、4 h，連續(xù)90 d。除煙霧暴露外，各組動物其他飼養(yǎng)條件相同。

1.4測量指標

1.4.1尾動脈無創(chuàng)測壓 打開儀器預熱、定標后，固定大鼠，將加壓套固定至大鼠近尾根部。使鼠尾穿過脈搏傳感器，插入尾部加熱器中的加熱管內，保持鼠尾正好處于脈搏傳感器的“脈搏信號傳感片”上方。調節(jié)鼠尾壓迫片至傳感片緊貼鼠尾下方的尾動脈，待大鼠脈搏穩(wěn)定，開始測量血壓。

1.4.2頸動脈插管 麻醉后，手術暴露右頸總動脈5～8 mm，游離的動脈兩端用動脈夾固定。將套管穿刺針沿動脈走行刺入，拔出穿刺針，將動脈近心端動脈夾取下，僅留套管于動脈。手持針柄將套管小心送入心臟方向，至顯示壓力波形為左心室壓力為止。

1.4.3體外血管環(huán) 設定水浴鍋溫度為37 ℃，調至“液溫”檔。打開BL-420S生物機能實驗系統(tǒng)，定標、定張力、定零值。處死大鼠后，迅速取出胸主動脈，置于持續(xù)通有95% O2+5% CO2混合氣體的Krebs液中。于解剖顯微鏡下，用眼科剪剔除多余的結締組織和脂肪組織，沖凈血管內余血，剪成4～5 mm的血管環(huán)后，小心穿至張力傳感器的三角環(huán)上。倒入10 ml Krebs液于浴槽并持續(xù)通混合氧，給予靜息張力0.5 g，孵育1 h，每15 min換液1次。放液，加入10 ml高K+溶液進行血管預收縮刺激，13 min待穩(wěn)定后Krebs液洗掉高鉀溶液，每10 min換一次液。加入10 ml Krebs液接著加10 μl PE(10 mmol/L)，計時13 min。穩(wěn)定后，由低到高依次加入濃度為0.01、0.1、1、10 mmol/L的Ach溶液，觀察濃度梯度下血管內皮依賴的舒張活性。

1.4.4血清NO、MDA、GSH-Px的含量和SOD活性含量測定 麻醉后，行頸總動脈取血，于4 ℃下離心15 min(1 500 r/min)分離血清，然后按試劑盒說明測定血清中NO含量、MDA、GSH-Px的含量和SOD活性檢測。

1.4.5ELISA檢測 嚴格按試劑盒，用ELISA檢測血清、心肌組織和肺組織中白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素10(interleukin-10, IL-10)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、內皮型一氧化氮合酶(endothelial NO synthase, eNOS)水平。

2 結果

2.1長期吸入尼古丁對SD大鼠心重指數、肺重指數和腎重指數的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組體重和心重有降低趨勢，其中尼古丁中劑量組體重和心重降低明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。尼古丁低劑量組心重指數(HW/BW)及尼古丁高劑量組肺重指數(LW/BW)和腎重指數(KW/BW)降低明顯。見表1。

2.2長期吸入尼古丁對SD大鼠尾動脈壓的影響與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組動脈血壓都有明顯的不同程度的上升趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖1。

表1 長期吸入尼古丁對SD大鼠心重指數、肺重指數和腎重指數的影響

與對照組比較：**P<0.01

表2 長期吸入尼古丁對SD大鼠心功能的影響

HR：心率；LVSP：左心室收縮壓；LVEDP：左心室終末舒張壓；+dp/dtmax：左心室內壓最大上升速率；-dp/dtmax：左心室內壓最大下降速率；ABP：頸動脈壓；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖1 長期吸入尼古丁對SD大鼠尾動脈壓的影響

2.3長期吸入尼古丁對SD大鼠心功能的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對照組比較，尼古丁高劑量組左心室收縮壓與舒張壓明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組動脈血壓發(fā)生不同程度的增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

2.4長期吸入尼古丁對SD大鼠血管舒張功能的影響與對照組比較，尼古丁高劑量組對乙酰膽堿誘導的內皮依賴性舒張反應有明顯的下降趨勢，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.5長期吸入尼古丁對SD大鼠血清NO含量及心、肺、血清eNOS表達的影響與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組血清NO有不同程度的下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖3。心、肺、血清eNOS含量均有明顯的降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖2 長期吸入尼古丁對SD大鼠血管舒張功能的影響

圖3 長期吸入尼古丁對SD大鼠血清NO含量的影響

1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖4 長期吸入尼古丁對SD大鼠心、肺、血清eNOS表達的影響

A：心肌組織中eNOS蛋白表達；B：肺組織中eNOS蛋白表達；C：血清中eNOS蛋白表達；1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：**P<0.01

2.6長期吸入尼古丁對SD大鼠血清MDA、GSH-Px含量及SOD活性的影響與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組血清MDA含量明顯降低，GSH-Px含量明顯升高，SOD活性增加。其中，尼古丁低劑量和中劑量組MDA含量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；尼古丁低、中劑量組GSH-Px有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)；尼古丁低劑量組SOD活性增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.7長期吸入尼古丁對SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對照組比較，尼古丁低、中劑量組血清中TNF-α量顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。尼古丁低、中、高劑量組血清中IL-1β量幾乎無變化，差異無統(tǒng)計學意義；與對照組比較，尼古丁低劑量和中劑量組血清IL-10量顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖6。

圖5 長期吸入尼古丁對SD大鼠血清MDA、GSH-Px含量及SOD活性的影響

A：MDA；B：GSH-Px；C：SOD活性；1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01

圖6 長期吸入尼古丁對SD大鼠血清TNF-α、IL-1β、

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：**P<0.01

2.8長期吸入尼古丁對SD大鼠肺TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10 含量都有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖7。

2.9長期吸入尼古丁對SD大鼠心肌TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響SD大鼠長期吸入尼古丁后，與對照組比較，尼古丁低、中、高劑量組心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見圖8。

3 討論

圖7 長期吸入尼古丁對SD大鼠肺組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：**P<0.01

煙草中含有多種生物活性物質，其中最重要的活性成分是尼古丁，而尼古丁是引起肺部疾病，心血管疾病和免疫功能障礙發(fā)展中的主要危險因素[3]。氧自由基的產生可抑制eNOS的活性，進而影響NO和內皮素1(endothelin-1, ET-1)的釋放[4]。血管內皮細胞是一層覆蓋在血管管腔的單層細胞，已證實內皮具有活躍的內分泌功能，通過釋放多種介質，參與血管的收縮與舒張，血管的生成以及炎癥反應[5]。各種物理化學因素、氧化應激、炎癥等都可造成血管內皮的損傷，而內皮損傷是高血壓、冠心病等疾病發(fā)展的重要病理學基礎。尼古丁通過改變NO緩激肽，內皮素和白三烯的釋放來影響血管張力，其中NO是血管內皮細胞合成和分泌最重要的血管舒張因子，作為反映血管受損程度及功能的一項指標，在調控血管張力中有著重要意義。血管內皮細胞通過eNOS生成NO，eNOS是誘導合成NO的關鍵性限速酶，eNOS/NO信號通路與高血壓等內皮功能障礙相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。

圖8 長期吸入尼古丁對SD大鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量的影響

A：TNF-α；B：IL-1β；C：IL-10；1：對照組；2：尼古丁低劑量組；3：尼古丁中劑量組；4：尼古丁高劑量組；與對照組比較：**P<0.01

活性氧(reactive oxygen species，ROS)引起細胞的毒性過程稱為氧化應激，在調控血管張力和內皮功能中有著重要意義。尼古丁可增加血液ROS 的產生，且存在劑量依賴性[6]。其中，過氧化的脂質可分解產生MDA，因此MDA的含量可作為一項細胞受損程度和自由基產生情況的指標。而GSH-Px和SOD在吸煙介導的氧化應激中都有著重要的保護作用，兩者可以用來評價氧化應激的影響程度[7]。本實驗結果表明，大鼠血清SOD活性升高，GSH-Px含量增加，而MDA含量明顯降低，其機制可能與尼古丁通過作用于煙堿型乙酰膽堿受體，同時激動交感神經系統(tǒng)和副交感神經系統(tǒng)，引起的機體氧化-抗氧化水平的失衡有關。

TNF-α作為機體創(chuàng)傷或感染后產生最早的炎性因子之一，TNF-α的水平是反映肺部感染及病變程度的良好指標。而IL-1β與TNF-α有十分相似的作用，在肺部炎性疾病早期，IL-1β參與肺部炎性疾病的發(fā)病過程，在急性肺損傷中，IL-1β較早生成，可誘發(fā)、放大炎癥反應，臨床上以其水平的高低來判斷肺損傷程度[8-12]。同時IL-1β也會導致肺纖維化，主要誘導炎癥反應，可通過協(xié)同TNF-α并促進其他炎性因子的表達，進而加強炎性反應程度[13]。IL-10是由Th2 細胞產生的一種細胞因子，是強有力的抗炎因子。尼古丁抑制促炎細胞因子TNF-α，IL-1β和IL-12的產生，同時刺激IL-10的分泌，通過作用于煙堿受體發(fā)揮抗炎作用[14]。本實驗結果顯示，尼古丁低、中、高劑量組的心、肺組織TNF-α、IL-1β、IL-10含量均明顯升高，說明尼古丁的吸入可引起大鼠心、肺組織的炎癥反應。

綜上所述，本實驗采用載氣吹掃尼古丁吸入法，觀察到尼古丁可引起大鼠內皮細胞功能紊亂和血壓的升高，氧化應激的失衡和心、肺組織的炎癥及心功能的損傷，其深入機制有待進一步探討。

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