敲減EEF1D的人卵巢癌細胞的構建及其藥物敏感性研究

汪慎燚，徐 恰，阮 昕，席 浩，王 鵬，陳 曦，秦宜德

卵巢癌居婦科惡性腫瘤死亡原因的首位，近年來卵巢癌的發病率有明顯上升和年輕化趨勢，由于其發病隱匿，缺乏普查和有效的早期診斷方法，70%以上的患者就診時已屬于晚期，治療及預后極差[1]。目前根治卵巢癌的主要方法仍是早期手術切除，而晚期患者主要以順鉑(cis-dichlorodiamineplatinum，DDP)化療為主，患者易對其產生耐藥性，但卵巢癌是高頻轉移的惡性腫瘤，術后極易復發，所以，控制復發和轉移是當今卵巢腫瘤治療的最大難題之一[2]。生物活性肽在腫瘤治療中有增敏、增效和減毒的作用，其逆轉腫瘤細胞耐藥的研究已取得一定的成果[3-6]。從牛酪蛋白酶產物中分離出的六肽(Pro-Gly-Pro-Ile-Pro-Asn，PGPIPN)是具有免疫功能的免疫調節肽[7]。已有報道[8]，真核生物翻譯延長因子1δ(eukaryotic translation elongation factor 1 delta，EEF1D)可能是PGPIPN的結合靶點，EEF1D的活性高低可能直接影響細胞的耐藥性，通過有效的RNA干擾誘導細胞內與其序列同源的靶基因mRNA降解而引起的轉錄后基因沉默，已成為逆轉腫瘤耐藥的新策略。該研究旨在通過干擾EEF1D基因表達，探討DDP/PGPIPN聯合用藥是否可增強抑制人卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP的生長，觀察人卵巢癌耐藥細胞DDP、PGPIPN敏感性的影響，為尋求新的卵巢癌治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株、菌株與載體 人卵巢癌細胞SKOV3、人卵巢癌耐藥細胞SKOV3/DDP購自中國醫學科學院北京腫瘤研究所；293T細胞由安徽醫科大學生物化學與分子生物學實驗室保存；慢病毒載體系統pLJM1、Δ8.91、pVSVG由南京醫科大學李建民教授惠贈。

1.1.2抗體及主要試劑 相應蛋白的辣根酶標記二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；限制性內切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和T4連接酶購自上海生工生物工程股份有限公司；質粒DNA提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Lipofectamine3000購自美國Invitrogen公司；PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；DMED培養基購自美國GIBCO公司；新生小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；ECL-增強化學發光檢測試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 SKOV3、SKOV3/DDP細胞采用含10%胎牛血清的DMEM/高糖培養基培養。293T細胞用含10%胎牛血清DMEM/高糖培養基培養。37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養環境中培養。當細胞在對數生長期，狀態良好并且密度達到約85%時，使用0.4%的胰酶消化后，進行傳代、凍存或其他實驗。

1.2.2EEF1D的siRNA的設計和篩選 針對人EEF1D基因設計三條siRNA，以Scrambled siRNA為對照，由上海生工生物工程股份有限公司合成。見表1。將合成的siRNA用脂質體(Lipofectamine 3 000)瞬時轉染至SKOV3和SKOV3/DDP，用RT-PCR篩選出下調EEF1D效果最佳的siRNA。

表1 人EEF1D mRNA靶點序列及陰性對照序列

1.2.3慢病毒干涉載體構建及包裝 根據篩選出的siRNA設計并合成能表達其發卡結構的shRNA序列。見表2。在其序列末端同時設計有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切識別位點。由上海生工生物工程股份有限公司合成。合成的寡鏈核苷酸模板退火，與雙酶切后回收的慢病毒載體pLJM1-shRNA連接。轉化DH5α大腸桿菌、挑陽性克隆、提取質粒，由上海生工生物工程股份有限公司測序驗證。

取成功構建的重組慢病毒載體pLJM1-shRNA-EEF1D及慢病毒包裝輔助質粒(Δ8.91、pVSVG)共轉染293T細胞。轉染前2 h將細胞培養基更換為Opti-MEM ⅠReduced Serum Medium。轉染后培養6 h更換為含血清的完全培養基培養。轉染48 h后收集含病毒的上清液，3 000 r/min離心15 min，0.45 μm的濾器過濾去除沉淀，-80 ℃保存備用。

1.2.4孔稀釋法測定病毒滴度 測定前1天將對數期狀態良好的293T細胞消化稀釋至1.0×105/ml，加入96孔板，100 μl/孔，每個病毒6個孔。感染當日將含有病毒的上清液，在EP管中做連續6個10倍梯度稀釋。棄去96孔板中原有的培養基，將稀釋好的病毒液100 μl/孔加到細胞孔中，繼續培養24 h后，每孔加入100 μl新鮮培養液。72 h后觀察熒光并計數最大稀釋倍數孔中的帶有熒光的細胞個數。病毒滴度(TU/ml=熒光細胞個數)×稀釋倍數/病毒體積。

1.2.5慢病毒感染目的細胞及穩定篩選 接種狀態良好的SKOV3、SKOV3/DDP細胞至6孔板，待細胞融合度達到70%時開始感染病毒。同時向培養基中加入終濃度為6 μg/ml的Polybrene。6 h后更換完全培養基。次日重復感染1次，72 h在顯微鏡下觀察感染情況，加入嘌呤霉素2 μg/ml培養篩選培養2周，直至單克隆細胞群形成。

1.2.6細胞總RNA提取、逆轉錄和RT-PCR 使用TRIzol總RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，NanoDrop 2 000 C超微量分光光度計測定其濃度和光密度(optical density，OD)OD260/OD280比值，并采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對RNA質量進行快速分析。取1 μg總RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit對RNA進行反轉錄成總cDNA，并稀釋10倍作為RT-PCR模板。利用Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)進行RT-PCR檢測，EEF1D上游引物：5′-GTATCTCCCATGCGCCAAGT-3′；下游引物：5′-ATCCAGCAGGATGGAGGACT-3′；擴增長度210 bp。 β-actin上游引物：5′-ATCCAGGCTGTGCTATCCCT-3′；下游引物：5′-TTGCCAATGGTGATGACCTG-3′；擴增長度350 bp。反應體系50 μl，每組樣品設置3個重復；PCR反應條件：95 ℃預變性10 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s共30個循環，72 ℃ 10 min。采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.7細胞總蛋白提取和Western blot 收集細胞前PBS洗2次，加入300 μl RIPA裂解液在冰上裂解30 min,每隔10 min顛倒混勻1次，4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取上清加入上樣緩沖液100 ℃水浴10 min，用BCA法進行蛋白定量。采用12.5%的SDS-PAGE分離膠電泳分離細胞總蛋白，電轉移法將蛋白轉移至PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉2 h后，與按要求稀釋的一抗中4 ℃孵育過夜。次日將TBST洗脫后的PVDF膜置于按要求稀釋的二抗中，室溫孵育1 h后，TBST洗脫ECL顯色。Quantity One軟件測定結果，采用β-actin作為內參照，分別以相應蛋白與β-actin光密度比值表示該蛋白質相對表達水平。

表2 篩選的單鏈及shScrambled DNA序列

1.2.8MTT檢測 用0.4%胰蛋白酶消化并收集對數生長期細胞，調整細胞密度，接種至96孔板中，每孔100 μl。次日加入按要求配置的DDP、PGPIPN、PIPIPN/DDP濃度，每一濃度設6個復孔，空白對照加入等體積的培養基，繼續培養48 h。每孔加入MTT液(5.0 mg/ml)20 μl，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩混勻5 min。在酶標儀上于490 nm波長處檢測每孔OD值，上述實驗重復3次。增值抑制率IR(%)=(1-給藥組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

2 結果

2.1瞬時轉染后EEF1DmRNA表達水平通過Quantity One進行灰度分析，以EEF1D基因與內參照β-actin的灰度值比值作為目的基因的mRNA相對表達量，結果顯示與非特異性轉染組Scrambled siRNA相比，siRNA3處理后EEF1D mRNA轉錄明顯減少(P<0.05)。見圖1。

2.2成功構建pLJM1-shRNA-EEF1D慢病毒載體經雙酶切的pLJM1-shRNA與退火后的shRNA連接重組形成慢病毒載體。由DH5α大腸桿菌感受態細胞轉化，將轉化成功的單個菌落接種于相應的含有氨芐青霉素抗生素的LB培養基，長出克隆后提取質粒，由上海生工生物工程股份有限公司測序證實插入序列正確，說明成功構建載體。見圖2、3。

2.3慢病毒包裝和滴度測定并感染目的細胞重組慢病毒載體和Negative control表達載體分別和包裝輔助質粒共轉染293T細胞。采用孔稀釋法測定慢病毒滴度為3.08×107TU/ml，見圖4。將收集的慢病毒連續2次感染目的細胞，通過puromycin反復篩選得到穩定轉染pLJM1-shRNA-EEF1D的SKOV3/DDP細胞株。同樣方法獲得穩定轉染pLJM1-shRNA-Negative control的對照組SKOV3/DDP細胞株。

2.4目的細胞中RNA干擾效果的檢測提取非特異性轉染組SKOV3 shScrambled、非特異性轉染組SKOV3/DDP shScrambled、特異性轉染組SKOV3 shEEF1D、特異性轉染組SKOV3/DDP shEEF1D、對照組SKOV3與對照組SKOV3/DDP的總RNA和總蛋白，RT-PCR和Western blot分析結果顯示SKOV3 shEEF1D與SKOV3/DDP shEEF1D中EEF1D的表達均受到干擾。在mRNA水平上，與SKOV3 shScrambled、SKOV3/DDP shScrambled相比SKOV3 shEEF1D、SKOV3/DDP shEEF1D明顯敲減EEF1D mRNA的表達(F=95.94，P<0.05)，見圖5。在蛋白水平上，SKOV3 shEEF1D、SKOV3/DDP shEEF1D組EEF1D表達量降低(F=133.96，P<0.05)，見圖6。因此獲得穩定敲減EEF1D基因的SKOV3/DDP、SKOV3細胞株用于下一步細胞實驗分析。

圖1 3條siRNA瞬時轉染后對EEF1D mRNA表達的影響

A：瞬時轉染后各組β-actin的表達；B：瞬時轉染后各組EEF1D 的表達；C：RT-PCR灰度值分析瞬時轉染效果；1：EEF1D siRNA1；2：EEF1D siRNA2；3：EEF1D siRNA3；4：Scrambled siRNA；M： Marker；與非特異性轉染組Scrambled siRNA相比較：*P<0.05

圖2 慢病毒載體構建

A：慢病毒載體質粒雙酶切；B：線性化質粒回收；C：空載體與重組載體電泳；M：Marker

2.5MTT檢測EEF1D基因敲減前后細胞增殖的影響MTT結果顯示通過敲減EEF1D基因，DDP和DDP+PGPIPN對細胞均增強增殖抑制作用，DDP聯合PGPIPN具有協同/相加作用，與SKOV3 shScrambled、SKOV3/DDP shScrambled及對照組相比較差異均有統計學意義(P<0.05),且通過敲減EEF1D基因的SKOV3/DDP對DDP的敏感性更高。見圖7。

圖3 感受態細胞轉化與陽性克隆測序鑒定

圖4 GFP陽性細胞數測定慢病毒滴度

圖5 RT-PCR檢測RNA干擾前后對細胞內EEF1D基因表達的影響

A：穩定轉染后各組β-actin的表達；B：穩定轉染后各組EEF1D 的表達；C：RT-PCR灰度值分析穩定轉染效果；1：對照組SKOV3；2：對照組SKOV3/DDP；3：非特異性轉染組SKOV3 shScrambled；4：非特異性轉染組SKOV3/DDP shScrambled；5：特異性轉染組SKOV3 shEEF1D；6：特異性轉染組SKOV3/DDP shEEF1D；M： Maker；與非特異性轉染組相比較：*P<0.05；與對照組比較：#P<0.05

圖6 Western blot檢測RNA干擾前后對細胞內EEF1D蛋白表達的影響

A：穩定轉染后細胞EEF1D和β-actin的蛋白表達；B：Western blot灰度值分析穩定轉染效果；1：對照組SKOV3；2：對照組SKOV3/DDP；3：非特異性轉染組SKOV3 shScrambled；4：非特異性轉染組SKOV3/DDP shScrambled；5：特異性轉染組SKOV3 shEEF1D；6：特異性轉染組SKOV3/DDP shEEF1D；與非特異性轉染組相比較：*P<0.05；與對照組相比較：#P<0.05

3 討論

EEF1D復合物由非核糖體蛋白酶因子組成，在其GTP結合形式中，通過將氨酰基tRNA分子募集到核糖體來介導蛋白質的合成[9]。有研究[10]表明，EEF1家族的δ可能在癌癥中發揮作用。卵巢癌中EEF1D基因過度表達，同時體現在乳腺癌，肝癌，食管癌等其他惡性腫瘤中。Flores et al[11]發現，EEF1D在口腔鱗狀細胞癌(OSCC)中過表達，并顯示EEF1D和蛋白質相互作用促進激活細胞周期蛋白D1和波形蛋白，通過敲減EEF1D基因的表達，明顯抑制OSCC增殖。另一方面，研究[12]通過EEF1D敲減使SNAIL1，ZEB1和ZEB2的表達下調直接激活上皮細胞-間充質轉化(EMT)過程增強腫瘤細胞的遷移和侵襲，這說明通過下調EEF1D的表達可以緩解腫瘤的發生。提示著EEF1D在腫瘤的發生和發展中扮演了重要的角色，但是在卵巢癌細胞中，下調EEF1D對卵巢癌細胞的增殖和遷移是否起到抑制作用，國內尚未見報道。

圖7 MTT檢測EEF1D基因敲減前后細胞增殖的影響

1：PGPIPN；2：DDP；3：DDP+低PGPIPN；4：DDP+中PGPIPN；5：DDP+高PGPIPN；A：各組對卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP增殖的影響；B：各組對卵巢癌細胞株SKOV3增殖的影響

卵巢癌的化療耐藥是制約卵巢癌治愈率提高的關鍵因素，卵巢癌化療耐藥是多基因調控的過程，其逆轉機制較為復雜，目前研究尚處于探索階段。有研究認為通過抑制多耐藥基因1(MDR1)的功能，可以逆轉耐藥。已有研究[13]顯示一些生物活性肽能夠逆轉卵巢癌細胞的多藥耐藥性。乳源六肽PGPIPN是一種生物活性肽，已有研究證明PGPIPN具有提高機體免疫功能、誘導免疫細胞分泌細胞活性因子和誘導腫瘤細胞凋亡等途徑而具有抗卵巢癌功能。其機制可能是EEF1D是PGPIPN的結合靶點，間接沉默了EEF1D基因通過激活小G蛋(Ras)而激活MAPK和/或PI3K/Akt信號轉導通路，減弱了細胞修復和抗凋亡能力，進而減弱卵巢癌細胞的耐藥性[14]。因此結合下調EEF1D的表達，PGPIPN聯合抗腫瘤藥物用藥是否使卵巢癌細胞增殖受到明顯的抑制尚不清楚。

本研究通過特異性強、效率高的RNA干擾技術提供了一個逆向研究EEF1D基因在卵巢癌化療耐藥中作用的方法，而設計和構建敲減EEF1D基因的shRNA慢病毒表達載體是本實驗的關鍵[15]。本研究成功構建的重組慢病毒表達載體，經過實驗證明明顯下調SKOV3/DDP、SKOV3細胞中EEF1D表達，經過嘌呤霉素篩選后獲得穩定敲減EEF1D基因的SKOV3/DDP、SKOV3細胞模型。本研究顯示對EEF1D敲減后，與對照組相比DDP增強了對細胞增殖抑制率，DDP+高濃度的PGPIPN聯合用藥明顯增強了藥物作用，細胞增殖抑制率明顯增高，其機制可能是RNA干擾的直接沉默與PGPIPN結合EEF1D靶點間接沉默的疊加結果。與SKOV3細胞相比，通過敲減EEF1D基因的SKOV3/DDP對DDP的敏感性更高，闡述了EEF1D能夠在卵巢癌細胞耐藥中起調節作用。該研究為進一步探索EEF1D在卵巢癌的化療耐藥中的作用奠定了基礎。為乳源生物活性肽抗癌及其逆轉癌細胞耐藥性帶來了新的曙光。

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