EGFR通過IL-6/STAT3信號通路對肺癌細胞增殖及凋亡的影響*

韓瑛 胡玉林 曹慧秋 李曉杰 陳志軍

(1.湘南學院基礎醫學院，湖南 郴州 423000；2.郴州市第一人民醫院病理診斷中心，湖南 郴州 423000)

肺癌是患病率及病死率較高的惡性腫瘤之一，盡管目前臨床采用手術及放化療、靶向治療等方式治療，但患者5年生存率仍不足15%[1-3]。因此，進一步探索肺癌發病相關機制及有效治療靶點對于提高其治療效果具有重要意義。表皮生長因子受體(Eidermal growth factor receptor，EGFR)是一種跨膜受體酪氨酸激酶，其異常表達與肺癌發生發展有關[4]。抑制EGFR表達可顯著抑制非小細胞肺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡。白介素-6(Interleukin-6，IL-6)是一種炎癥因子，與其可溶性IL-6受體結合可引發Janus蛋白酪氨酸激酶/信號轉導子與轉錄激活子(Janus protein tyrosine kinase/Signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)信號通路活化進而參與腫瘤進展[5-6]。張曼澤等[7]研究顯示，IL-6可通過調節JAK/STAT3信號通路促進肺腺癌細胞增殖、侵襲及遷移。然而關于EGFR對肺癌細胞增殖、凋亡的影響是否與調控IL-6/STAT3通路有關報道鮮少，因此，本研究主要探究EGFR對肺癌細胞增殖、凋亡的影響以及其作用機制，旨在為肺癌的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人正常支氣管上皮細胞16HBE及肺癌細胞A549、H1299、MSTO-211H購自北京百歐博偉生物技術有限公司。RPMI-1640培養基(CDLG-3719)購自武漢純度生物科技有限公司；CCK-8試劑盒(CA1210-500T)、AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(HUDY03)購自上海碧云天公司；Hoechst33258熒光染料(B8040)購自北京索萊寶科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑盒(L2000-015)購自杭州沃森生物技術有限公司；EGFR過表達質粒載體pcDNA3.1-EGFR及不含EGFR的對照質粒pcDNA3.1由上海吉瑪生物科技有限公司設計合成；IL-6中和抗體anti-IL-6(T9911)購自TargetMol(中國)有限公司；BCA試劑盒(批號2763DB)、蛋白提取試劑盒(BC3710-100T)購自上海吉至生化科技有限公司；兔抗EGFR( K009458P)、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)(AF0931)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(FNab00839)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein，Bax)(2774)、IL-6(FNab04282)、JAK(ET1705-84)、p-JAK(130-10568-200)、STAT3(FNab08298)、p-STAT3(RT1490)、β-actin(ATA40114)、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。CO2培養箱(型號CCL-050A-8)購自日本Esco公司；Elx800酶標儀(型號HSG9832)購自美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 取16HBE、A549、H1299、MSTO-211H細胞解凍、復蘇，于含10%滅活胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)+RPMI-1640培養液、37℃、5%CO2、95%O2培養箱中培養，換液/2 d，傳代培養，進行后續實驗。

1.2.2 細胞分組及處理 取對數生長期的MSTO-211H細胞接種于48孔板(1.5×105個/孔)。依據LipofectamineTM2000轉染試劑盒說明書，先將脂質體LipofectamineTM2000分別與質粒載體pcDNA3.1-EGFR、pcDNA3.1以8 μL∶4 μg比例在250 μL Opti-MEM中稀釋，后分別混勻后加入培養液中，對細胞進行轉染，分別為pcDNA3.1組(陰性對照組)、pcDNA3.1-EGFR組(過表達EGFR組)；同時設置未轉染細胞的NG組(空白對照組)，以及轉染pcDNA3.1-EGFR后，分別加入IL-6中和抗體anti-IL-6(0.5 μg/mL)及STAT3特異性抑制劑JSI-124(10μmol/L)[8]的培養液培養細胞，并命名為pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組。繼續培養細胞48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度，每組設置6個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR法檢測EGFR mRNA表達水平 按照試劑盒說明書提取各組MSTO-211H細胞中總RNA并測定濃度及純度；以RNA為模板行逆轉錄反應，所得cDNA進行實時熒光定量PCR反應。體系20 μL：ULtraSYBR mixture(10 μL)、模板cDNA(2.0 μL)、上下游引物(各2.0 μL)、去離子純化水(4.0 μL)；條件(40個循環)：93℃ 30 s、93℃ 5 s、65℃ 30 s。引物序列見表1，由赫澎(上海)生物科技有限公司設計并合成，以β-actin為內參，以2-ΔΔCt法計算EGFR mRNA含量。

表1 引物設計Table 1 Primer design

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖情況 取各組培養48 h的MSTO-211H細胞經胰酶消化，接種至48孔板(1.5×105個/孔)，嚴格按照CCK-8試劑盒說明書分別于培養24 h后加入CCK-8試劑，繼續培養2 h，檢測450 nm處各孔細胞光密度(Optic density，OD)值，重復3次，取平均值。

1.2.5 平板克隆實驗檢測各組細胞克隆形成率 取各組培養48 h后的MSTO-211H細胞，消化并接種于6孔板(500個細胞/孔)，每組6個復孔，于37℃、5%CO2、95%O2條件下培養15 d，加入4%多聚甲醛固定30 min，0.25%結晶紫染色30 min；棄掉染液，晾干，拍照并計算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.2.6 Hoechst333258染色法檢測各組細胞凋亡形態學變化 取各組培養48 h的MSTO-211H細胞，消化并接種于48孔板(1.5×105個/孔)，繼續培養24 h，加入4%多聚甲醛(pH=7.5)，37℃固定30 min，PBS沖洗、晾干，加入Hoechst333258染液(5 mg/mL)，染色30 min，PBS沖洗、封片，熒光顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.7 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 取各組培養48 h的MSTO-211H細胞接種于48孔板(1.5×105個/孔)，參照Annexin-V FITC/PI試劑盒說明書，以5 μL PI+5 μL Annexin V-FITC雙染試劑4℃避光進行染色30 min，稀釋；用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設6個復孔，重復3次。

1.2.8 免疫印跡法檢測EGFR、增殖、凋亡及IL-6/STAT3信號通路相關蛋白表達情況 取各組培養48 h的MSTO-211H細胞，以RIPA裂解并提取總蛋白，檢測濃度及純度，行12%SDS-PAGE電泳，轉膜，放入脫脂奶粉(5%)溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗EGFR、增殖相關蛋白(PCNA)、凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax)、IL-6/STAT3通路相關蛋白(IL-6、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3)、內參β-actin，均為1∶500的稀釋比，4℃過夜，加入HRP標記山羊抗兔二抗(1∶1000)，室溫孵育1 h，顯影、定影，半定量分析各蛋白含量。

2 結果

2.1 EGFR mRNA及蛋白在肺癌細胞中的表達比較 16HBE、A549、H1299、MSTO-211H細胞中EGFR mRNA相對表達量分別為：1.00±0.11、2.16±0.14、1.85±0.13、1.39±0.14，EGFR 蛋白相對表達量分別為：0.23±0.02、0.95±0.06、0.72±0.05、0.54±0.03。與人正常支氣管上皮細胞16HBE比較，人肺癌細胞A549、H1299、MSTO-211H中EGFR mRNA及蛋白表達水平顯著升高，且MSTO-211H細胞中EGFR mRNA及蛋白表達水平最低，因此，選擇MSTO-211H細胞進行后續實驗，見圖1。

圖1 western blot檢測細胞中EGFR蛋白表達Figure 1 Western blot detection of EGFR protein expression in cells

2.2 細胞株轉染效果 倒置熒光顯微鏡下觀察pcDNA3.1組、pcDNA3.1-EGFR組細胞轉染效果，鏡下均可見較強綠色熒光，NG組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-EGFR組中EGFR mRNA相對表達量分別為：1.00±0.16、0.99±0.15、1.56±0.23，EGFR 蛋白相對表達量分別為：0.52±0.04、0.55±0.03、1.12±0.17，pcDNA3.1-EGFR組EGFR mRNA及蛋白相對表達水平顯著高于NG組與pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖2、3。

圖2 細胞轉染效果(100×)Figure 2 Cell transfection effect

圖3 western blot檢測各組細胞中EGFR蛋白表達Figure 3 Western blot detection of EGFR protein expression in each group of cells

2.3 各組MSTO-211H細胞增殖情況比較 與NG組(0.54±0.07)、pcDNA3.1組(0.56±0.05)比較，pcDNA3.1-EGFR組(0.89±0.04)MSTO-211H細胞OD450值顯著升高(P<0.05)；與pcDNA3.1-EGFR組(0.89±0.04)比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組(0.65±0.06)、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組(0.67±0.04)MSTO-211H細胞OD450值顯著降低(P<0.05)。

2.4 各組MSTO-211H細胞平板克隆結果比較 與NG組(27.35±4.10)、pcDNA3.1組(26.67±4.01)比較，pcDNA3.1-EGFR組(76.27±11.45)MSTO-211H細胞克隆形成率顯著升高(P<0.05)；與pcDNA3.1-EGFR組(76.27±11.45)比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組(50.57±7.59)、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組(48.65±6.04)MSTO-211H細胞增殖抑制率顯著降低(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組MSTO-211H細胞平板克隆結果比較Figure 4 Comparison of plate cloning results of MSTO-211H cells in each group

2.5 各組MSTO-211H細胞形態學變化 Hoechst 33342染色顯示，NG組、pcDNA3.1組MSTO-211H細胞核皺縮破裂，胞核或胞質內有濃縮致密藍色熒光，呈細胞凋亡形態；pcDNA3.1-EGFR組MSTO-211H細胞細胞數增多，染色呈淺色熒光，亮藍色細胞核減少，凋亡活動減弱；與pcDNA3.1-EGFR組比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組MSTO-211H細胞凋亡活動增強。見圖5。

圖5 各組MSTO-211H細胞形態學變化(200×)Figure 5 The morphological changes of MSTO-211H cells in each group

2.6 各組MSTO-211H細胞凋亡情況比較 與NG組(38.91±5.38)、pcDNA3.1組(39.12±5.26)比較，pcDNA3.1-EGFR組(12.05±1.80)MSTO-211H細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-EGFR組(12.05±1.80)比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組(22.36±3.36)、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組(21.14±3.04)MSTO-211H細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖6。

圖6 各組MSTO-211H細胞凋亡情況比較Figure 6 Comparison of MSTO-211H cell apoptosis in each group

2.7 各組MSTO-211H細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較 NG組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-EGFR組、pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組中CyclinD1蛋白相對表達量分別為：0.51±0.08、0.52±0.07、1.28±0.18、0.86±0.13、0.88±0.12；Bax蛋白相對表達量分別為：1.09±0.16、1.10±0.15、0.45±0.02、0.71±0.11、0.72±0.13；Bcl-2蛋白相對表達量分別為：0.60±0.09、0.62±0.09、1.33±0.20、0.95±0.15、0.94±0.11。與NG組、pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-EGFR組MSTO-211H細胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與pcDNA3.1-EGFR組比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組MSTO-211H細胞CyclinD1、Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖7。

圖7 各組細胞增殖、凋亡相關蛋白表達比較Figure 7 Comparison of cell proliferation and apoptosis-related protein expression in each group

2.8 各組MSTO-211H細胞IL-6/STAT3通路相關蛋白表達比較 NG組、pcDNA3.1組、pcDNA3.1-EGFR組、pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組中IL-6蛋白相對表達量分別為：0.47±0.07、0.46±0.06、1.31±0.19、0.92±0.13、0.89±0.11；p-JAK蛋白相對表達量分別為：0.53±0.08、0.55±0.09、1.36±0.20、0.97±0.14、0.94±0.12；p-STAT3蛋白相對表達量分別為：0.68±0.11、0.70±0.11、1.25±0.19、0.87±0.13、0.88±0.12。與NG組、pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-EGFR組MSTO-211H細胞IL-6、p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3顯著升高(P<0.05)；與pcDNA3.1-EGFR組比較，pcDNA3.1-EGFR+anti-IL-6組、pcDNA3.1-EGFR+JSI-124組MSTO-211H細胞IL-6、p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3顯著降低(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組MSTO-211H細胞IL-6/STAT3通路相關蛋白表達比較Figure 8 Comparison of IL-6/STAT3 pathway related protein expression in MSTO-211H cells in each group

3 討論

肺癌的發病率及病死率于眾多惡性腫瘤中均居首位[9-10]，其發病早期癥狀不典型，大多患者于中晚期才得以確診。隨著醫療水平的不斷提高，肺癌診療方法也得到有效提升，主要包括手術輔以放化療或聯合治療等，但是此類積極治療措施并未獲得較理想療效，患者5年生存率仍只有15%左右[11-12]。因此深入研究肺癌發生發展相關機制，尋找新型生物學靶標提高肺癌治療效果依然是當務之急。

EGFR是位于染色體7p13.2-q22區的表皮生長因子受體家族成員之一，能夠將細胞外信號傳遞至細胞內，促使癌細胞增殖，參與乳腺癌、肺癌等腫瘤進展[13-15]。張超等[16]研究顯示，過表達EGFR可促進肺腺癌細胞增殖及轉移。腫瘤的發生發展是癌細胞增殖及凋亡失衡的結果，其中CyclinD1通過結合周期蛋白依賴性激酶(CDK)蛋白，促進細胞周期G1向S期正向轉換，進而促進細胞增殖[17]；Bcl-2、Bax是人體最主要細胞凋亡相關基因，分別發揮抑凋亡、促凋亡作用[18]。Hoechst33342可透過細胞膜，與DNA結合而發出藍色熒光，用以檢測細胞凋亡[19]。本研究成功轉染MSTO-211H細胞后，結果顯示，與NG組、pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-EGFR組細胞凋亡活動明顯減弱，且pcDNA3.1-EGFR組MSTO-211H細胞增殖抑制率、凋亡率、Bax蛋白表達顯著降低，克隆形成率、CyclinD1、Bcl-2蛋白表達顯著升高。與過往研究結果一致，說明過表達EGFR可能促進MSTO-211H細胞增殖并抑制細胞凋亡。

IL-6是黏膜固有層分泌的一種炎癥細胞因子，可與細胞膜上的可溶性受體sIL-6R結合形成復合物，與胞漿可溶性的JAK相結合并使JAK發生磷酸化反應被活化，活化的JAK可與STAT3特異性相結合且使STAT3發生磷酸化反應生成p-STAT3，p-STAT3可作用于細胞核內特異性DNA，調節基因轉錄，誘導腫瘤細胞增殖基轉移等[20-21]。Yang等[22]研究顯示，過表達miR-206可通過抑制IL-6/STAT3信號通路活化減弱EGFR陽性突變的肺癌細胞對吉非替尼的耐藥性。王金耀等[23]研究顯示，酪氨酸激酶抑制劑誘導的IL-6/STAT3通路激活降低了EGFR突變的非小細胞肺癌對艾克替尼的敏感性。包克勇等[24]研究發現，下調KLF12表達通過抑制IL-6/STAT3信號通路抑制宮頸癌細胞增殖、促進凋亡。Fan等[25]研究表明，ZIPK激活IL-6/STAT3信號通路可促進胃癌細胞增殖與侵襲。本研究結果顯示，與NG組、pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-EGFR組MSTO-211H細胞IL-6、p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3蛋白表達顯著升高。說明過表達EGFR促進MSTO-211H細胞增殖并抑制細胞凋亡可能與促進IL-6/STAT3信號通路活化有關。當在過表達EGFR基礎上抑制IL-6表達或者加入STAT3特異性抑制劑JSI-124后，過表達EGFR促進MSTO-211H細胞增殖并抑制細胞凋亡能力減弱。更加說明過表達EGFR可能通過促進IL-6/STAT3信號通路活化促進MSTO-211H細胞增殖并抑制細胞凋亡。

4 結論

過表達EGFR促進MSTO-211H細胞增殖并抑制細胞凋亡，可能是通過促進IL-6/STAT3信號通路活化實現的。該過程涉及的通路較多，有待后續進一步深入探究。