生物大分子高分辨率冷凍電鏡三維重構技術

程凌鵬

(清華大學 生命科學學院 蛋白質研究技術中心, 北京 100084)

冷凍電子顯微三維重構技術(簡稱冷凍電鏡)是20世紀80年代發展起來的一種透射電鏡技術,能夠解析生物大分子復合體的高分辨率三維結構。其特點是能夠解析的生物樣品的尺度較為寬泛,而且不需要樣品結晶,保持了樣品的近生理狀態。冷凍電鏡的這些特點與其他結構解析方法相比優勢明顯。X射線晶體學可以獲得生物大分子原子分辨率的三維結構,但其局限在于需要先獲得樣品的結晶。而對于分子量較大、較復雜的生物大分子復合體通常難以得到結晶的樣品,此外樣品在結晶后的結構可能會發生變化。核磁共振雖然能解析溶液中的蛋白結構,但是只能解析分子量在50 kD以下的小分子結構。由于近年來隨著電鏡硬件和計算機圖像處理技術的飛速發展,冷凍電鏡三維結構解析分辨率從最初的納米級推進到原子分辨率水平,一大批之前不能解析的生物大分子復合體的結構一下子變得可解,因此受到了生物學家的廣泛關注,逐漸成為生物大分子結構解析的主流方法之一。2017年諾貝爾化學獎授予了開創冷凍電鏡測定溶液中生物大分子復合體的高分辨率結構方法學的迪波什(Jacques Dubochet)、弗蘭克(Joachim Frank)和亨德森(Richard Henderson)3位科學家。本文介紹了冷凍電鏡高分辨率結構解析技術的起源、發展和未來趨勢。

1 冷凍電鏡技術的起源

1932年,德國物理學家魯斯卡(Ernst Ruska)和克諾爾(Max Knoll)首次研制出了世界上第一臺只有2個磁透鏡的電子成像裝置并將其命名為電子顯微鏡(簡稱電鏡)。該裝置最初的成像方法倍數只有十幾倍。此后,魯斯卡等人進一步改進了成像放大倍數和分辨率。他們的工作奠定了現代透射電鏡的基礎。因為電子的波長遠小于可見光,所以電鏡的分辨率遠大于光學顯微鏡,可以達到0.1 nm左右。魯斯卡也因此獲得1986年的諾貝爾物理學獎[1]。在第一臺電鏡在實驗室問世短短幾年后,首臺商業電鏡產品就被生產出來并很快在材料科學領域獲得了廣泛的應用。

由于樣品制備上的原因,電鏡在生物領域的應用晚于材料科學。為了避免電子和空氣分子發生碰撞散射,電鏡必須在高真空下工作。而活性生物樣品含有水分,真空會使其脫水從而破壞原有結構。此外,電子輻射也會破壞生物樣品化學鍵導致結構破壞。因此,如何盡可能地保持生物樣品的在電鏡觀察時的原有結構不發生變化是個問題。最早引入電鏡制樣的方法是負染。該方法用重金屬包裹樣品表面然后脫水干燥。這種方法雖然部分地解決了生物樣品的電鏡制樣問題并被生物學家廣泛地應用于生物樣品的觀察,但是其局限在于:(1)重金屬本身有可能會破壞樣品結構；(2)電鏡觀察到的只是樣品的表面形貌；(3)染料不可能完全均勻地分布在樣品表面。這些問題嚴重地限制了電鏡圖像分辨率。為了解決這些問題,格萊澤(Robert Glaeser)等人最早提出了利用冷凍的方法來降低樣品輻射損傷[2-3],但是他們用傳統方法獲得的晶態冰會導致生物樣品原有結構因為冰晶的產生而被破壞。迪波什和合作者在此基礎上做了改進,他們將溶液中的樣品迅速投入到液態乙烷中,樣品溶液被快速冷凍形成非晶態冰,然后將樣品放到液氮冷卻的電鏡冷臺上觀察。這樣既能保持生物樣品在冰中的原有結構,又避免了生物樣品在真空中脫水,并且在一定程度上降低了輻射損傷[4-5]。迪波什等人的工作標志著冷凍電鏡技術的誕生,這個方法至今仍被沿用。

2 冷凍電鏡結構解析的基本原理

2.1 樣品制備和電鏡成像

冷凍電鏡樣品的具體制作流程如圖1所示。首先,將高濃度和純度的生物大分子溶液樣品約4 μL加載到事先用親水化處理過的鋪有多孔碳膜的電鏡載網上,然后用濾紙吸掉多余的溶液,使得只剩下一層幾十到上百nm厚度的溶液薄膜留在碳膜上面。將該電鏡載網迅速投入到用液氮冷卻的液態乙烷中,這樣溶液被迅速冷凍,形成非晶態的薄冰。從而避免了冰晶的形成對生物樣品結構的破壞。不直接用液氮,而是乙烷,因為樣品和液氮接觸會迅速沸騰,產生的氮氣隔在樣品和液氮之間阻礙了熱傳導,從而形成晶態冰破壞樣品結構。電鏡圖像從碳膜上的孔內的薄冰層中采集。為了防止過度劑量的電子輻射對樣品的破壞,冷凍電鏡采用低電子劑量的成像方式。因為樣品純度很高,所有樣品顆粒的結構是均一的(具有相同的三維結構),而且冰中的樣品顆粒是隨機取向,每個樣品顆粒的電鏡圖像可以看作是單個顆粒從不同方向上的投影。顆粒的三維結構可以通過計算機重構的方法合并這些投影圖得到。因此,在冷凍電鏡制樣前用生化方法獲得結構均一的樣品非常重要。

由于冷凍電鏡樣品非常薄,而且主要由碳、氫和氧等輕原子構成,因此能滿足弱相位體近似(weak-phase object approximation),也就是說,可以認為入射電子通過樣品只發生一次彈性散射,振幅不變,相位變化很小。由于構成生物樣品的原子的原子量和水,接近以及成像采用較低的電子劑量,所以在正焦條件下電鏡圖像的襯度很小。因此樣品的圖像襯度主要通過成像時一定程度的離焦(通常是欠焦)來實現。由于圖像的欠焦和物鏡的球差效應,冷凍電鏡圖像沒有完全真實地反映樣品顆粒的投影,而是傅里葉空間被襯度傳遞函數(CTF)所調制的投影圖(見圖2)。CTF曲線可以寫為空間頻率S的函數[6]:

CTF(S)=-sin(γ(S)+Φ)

(1)

其中γ(S)=π((-Csλ3S4)/2+ΔzλS2),S是空間頻率,Q是振幅襯度在整個圖像襯度中所占的比例,由樣品厚度和電子能量所決定,在冷凍電鏡成像中約為0.1弧度；Cs是物鏡球差系數；λ是電子波長,由電鏡加速電壓決定；Δz是成像時的離焦值,由用戶給定。

圖2(a)是一張乳糖苷酶的電鏡圖像[7],圖2(b)是冷凍電鏡圖像的傅里葉變換圖，圖2(c)是CTF函數圖。從圖中可以看到,圖像的低頻部分只是有襯度反轉,而高頻信息則被完全扭曲。因此要從電鏡圖像中獲得高分辨率的生物樣品的投影圖像,必須先對圖像進行CTF校正。

2.2 電鏡圖像的計算機三維重構

生物樣品電鏡圖像三維重構在冷凍電鏡技術出現之前已經有人研究。1968年,克魯格(Aaron Klug)和德羅西耶(David DeRosier)用三維重構的方法合并多張噬菌體螺旋對稱的尾部負染電鏡圖像獲得了它的三維結構[8]。重構算法的基礎是中央截面定理:一個三維物體的二維投影的傅里葉變換是該物體的三維傅里葉變換中的垂直于投影方向的一個中央截面。如果可以獲得該物體在全空間中不同方向的投影,然后對每張投影圖進行傅里葉變換,并按投影方向填充到三維傅里葉空間對應的中央截面,并且如果投影的空間取向足夠多且均勻分布,那么其數據點就可以布滿該三維物體的整個三維傅里葉空間。對于三維傅里葉空間的空隙的部分可以通過插值計算得到。對該三維物體的傅里葉空間進行三維反傅里葉變換就可得到物體實空間的三維結構。此后,1971年克勞瑟(Richard Crowther)用類似的方法解析了首個二十面體對稱病毒衣殼的結構[9]。1975年亨德森等人首次用電鏡解析了細菌紫膜蛋白的二維晶體結構,并在1990年首次將推進到近原子分辨率水平[10-11],證明了電鏡結構解析分辨率的潛力。因為在生物大分子復合體電鏡圖像三維重構領域的開創性貢獻,克魯格獲得了1982年諾貝爾化學獎。

圖1 冷凍電鏡樣品制作流程圖

圖2 冷凍電鏡圖像及CTF函數圖

以上電鏡三維重構的共同特點是都利用了樣品的高對稱性或樣品形成有序排列的二維晶體。然而,多數生物大分子復合體沒有對稱性且難以形成二維晶體。1974年,弗蘭克針對這個問題提出通過對框取出的樣品顆粒圖像按照其相關性做分類,然后將相同類的圖像做二維平均以提高信噪比[12]。每一個類圖像平均代表了樣品顆粒在某個方向的投影圖,合并這些投影圖就可以獲得三維結構[13]。冷凍電鏡圖像三維重構的流程如下:

(1) 通過取向參數擬合的方法測定每一張圖像的欠焦值和像散并對圖像進行CTF校正。

(2) 獲得初始結構模板。顆粒結構的低分辨率初始結構可以采用與樣品同源的已知結構；如果沒有類似結構,就需要用收集樣品的傾轉圖像來獲得初始結構模板[14]。

(3) 把樣品顆粒圖像從電鏡圖像中框取出來并按照圖像的相似度進行歸類,對同一類的圖像進行平均,得到類平均圖像。

(4) 用投影匹配方法獲得每個類平均圖像的空間取向和中心,投影匹配法需要一個初始結構作為參考模板,程序首先對這個初始結構做全空間取向投影作為模板,然后將每張類平均圖像和這些投影模板用交互相關的方法做相似度比較,每張類平均圖像中的顆粒的空間取向被測定為與其相似度最大的投影模板的投影取向。

(5) 合并所有的被測定了空間取向和中心位置的類平均圖像進行三維重構。重構算法除了上面所說的傅里葉空間插值法外,還有反投影重構法[15]。

(6) 在得到了新的三維結構后,將該三維結構作為新的模板,重新匹配所有的顆粒。

(7) 循環迭代第(5)—(6)步,并不斷提高重構分辨率。最終的有效結構分辨率通過計算兩組獨立處理的顆粒圖像的重構結果的傅里葉變換的徑向相關性來獲得[16]。

3 冷凍電鏡技術發展

隨著電鏡硬件和軟件技術的不斷改進和提高,用冷凍電鏡技術解析的生物復合體結構的分辨率也在不斷提高。最初的三維重構分辨率只有2～4 nm[17-18]。在眾多非二維晶體的生物樣品中,由于二十面體病毒具有高度對稱性,總是最早獲得結構分辨率突破的大分子復合體。1997年,乙肝病毒的亞納米分辨率冷凍電鏡結構首次被測定。在0.7～0.9 nm的分辨率下,首次觀察到乙肝病毒衣殼蛋白中的α螺旋呈現棍狀結構[19-20]。2008年,首個用基于冷凍電鏡方法獲得的病毒衣殼蛋白的骨架模型被構建[21]。此后低對稱性和無對稱性的復合體結構也獲得了類似分辨率的結構[22-23]。近年來用冷凍電鏡結構達到可以直接構建原子模型的分辨率水平[24-25]。最具有代表性的工作是2013年程亦凡研究組和朱利葉斯研究組合作,首次使用基于直接電子探測技術的相機收集冷凍電鏡圖像重構獲得了大小僅為300 kD的一種辣椒素受體蛋白的0.34 nm分辨率的結構[26],表明冷凍電鏡技術解析較小的蛋白復合體結構也能獲得近原子分辨率水平。目前冷凍電鏡技術所獲得的結構分辨率已經突破0.2 nm,達到了X射線晶體學結構解析的分辨率水平[27]。

3.1 電鏡和相關設備的發展促進了電鏡圖像質量和采集效率的提高

冷凍電鏡結構解析分辨率的提高與技術的發展總是分不開的。電鏡高分辨率技術的一個較早的突破是場發射電子槍(FEG)的出現。場發射電子槍和熱電子槍相比能獲得相干性更好的電子光源,因此能獲得的圖像的襯度和分辨率更高。平行入射電子光源的應用進一步提高了電子穿過樣品后的相干性。磁透鏡的恒定功率系統增加了透鏡電流的穩定性。近年來開發的冷凍電鏡圖像自動收集軟件的普及使得電鏡可以在無人監督下24 h自動收集圖像,大大地減輕了使用者的勞動量,提高了結構解析的效率。電鏡樣品自動加載系統(autoloader system)的出現很大程度上減少了樣品的冰晶污染并增加了樣品臺的穩定性。冷凍樣品自動制樣機的推廣使得電鏡載網上冰的厚度可控性增加,大大提高了冷凍樣品制備的成功率和可重復性。

3.2 冷凍電鏡圖像質量的提高

因為冷凍電鏡成像的電子劑量低,且生物復合體的主要元素碳、氫和氧等原子量和構成水的原子量接近,所以冷凍電鏡技術的最大的瓶頸是圖像的襯度和信噪比低。電子輻照到樣品上導致樣品的抖動漂移進一步削弱了冷凍電鏡圖像的高分辨率信息。較低的電鏡圖像襯度和信噪比導致后期精確測定顆粒取向上的困難。直接電子探測技術(direct-electron detector device,DDD)的相機的使用極大地改善了冷凍電鏡圖像的質量。電鏡圖像采集器件的效率由電子轉換效率(detective quantum efficiency,DQE)也就是輸出信號和信噪比的平方和輸入信號的信噪比的平方的比值來衡量[28]。在DDD相機出現以前,冷凍電鏡圖像通常用電荷耦合器件(charge coupled device,CCD)相機或者攝影底片來收集。CCD相機收集圖像比底片要方便,而且在低頻區域的DQE較高。但因為CCD不能夠直接探測電子圖像信號,而是要通過閃爍體將電子信號轉換為光信號來獲得電鏡圖像,在轉換的過程中不可避免地引入了噪聲,所以其高頻信號的DQE較差。底片收集圖像的高頻區域的DQE雖然比CCD相機高[29],但是不能即時可見,而是需要后期顯影和掃描才能獲得數字圖像,使用起來很不方便。DDD相機因為可以直接探測電子信號,所以在各個頻率段的DQE都遠高于底片和CCD相機,極大地提高了電鏡圖像的襯度和信噪比。近年來DDD相機已成為冷凍電鏡圖像采集的標配。

除了DQE值高外,DDD還有一個特點是能夠以視頻的形式記錄,把一張圖像分為每秒鐘數十到數百幀的動畫圖像。DDD成像的這一特性使得在電鏡成像時的樣品漂移可以通過對這些幀圖像進行配準后平均來校正[30-31]。這樣就能減少或者避免因為樣品漂移導致的圖像模糊。DDD技術不僅提高了冷凍電鏡成像質量使得用同樣的數據量可以獲得更高分辨率的三維結構,而且是對解析1 000 kD以下的較小蛋白復合體結構突破到原子分辨率水平的最大的技術推動。

3.3 生物樣品三維分類和分辨率的提高

冷凍電鏡三維重構的一個特點是通過合并大量樣品顆粒圖像的平均圖實獲得樣品顆粒的三維結構,因而樣品中含有少量其他不同結構的雜質顆粒不影響最后的三維重構結果。如果樣品中所含不同結構的顆粒較多,尤其是同種樣品的多個不同構象之間具有較小結構差異,那么這些因素會導致平均圖像的模糊,最終影響重構分辨率的提高。生物樣品中這類情況很常見,尤其是同種樣品可能有不同的構象,每個構象都代表了樣品的一個和其生物功能相關的狀態。因此將不同構象的顆粒區分出來對研究其生物機制有重要意義。最大似然(maximum likelihood)方法應用在顆粒分類上能夠識別顆粒圖像究竟是某個顆粒的不同方向上的投影還是不同結構顆粒的投影[32]。通過這種方法,溶液中不同的顆粒可以按其三維結構的不同分為不同的類。這種分類也促進了重構分辨率的提高。

冷凍電鏡及其相關設備的一系列技術的改進和圖像三維重構軟件發展是相輔相成的。電鏡設備技術改進提高了圖像的襯度和信噪比,反過來更好質量的圖像也促進了三維重構圖像處理軟件的研發,這些因素共同推動了冷凍電鏡生物大分子復合體結構解析分辨率的革命性突破[33-34]。

4 冷凍電鏡技術的未來發展趨勢

從1997年報道的首個解析到亞納米分辨率的乙肝病毒的結構[19-20]到2016年報道的0.18 nm分辨率的谷氨酸脫氫酶(約300 kD)結構[27],冷凍電鏡結構生物學在這20年來經歷了飛速的發展。能夠用冷凍電鏡獲得近原子分辨率水平的結構的樣品范圍從最初的大到病毒這樣的超大分子復合物到現在的不到100 kD的小分子復合物[27],其解析小分子復合物的尺度范圍已經部分覆蓋到了原本只有X射線晶體學才能達到的范圍。目前冷凍電鏡結構解析技術已經非常成熟,只要有合適的大小、濃度和結構均一性的樣品,單純從結構解析技術上來說,要獲得樣品的高分辨率結構已經沒有挑戰性可言。但是在適用樣品的尺度普適性這一問題上依然有很多技術問題有待解決。例如,顆粒尺度太小會導致電鏡圖像的襯度低,在數據處理時難以準確地匹配圖像,目前仍然只有少數100 kD左右的小分子復合體用冷凍電鏡方法能夠獲得近原子分辨率的結構。此外,由于電鏡的場深有限,要解析較大的顆粒的樣品的原子分辨率結構仍然是一個挑戰。要讓冷凍電鏡高分辨率結構技術能夠適用更多的生物樣品,使結構解析變得更為普適,永遠是擺在冷凍電鏡方法學研究者面前的首要課題。

4.1 相位板技術為解析小分子結構提供了可能

從成像原理上,冷凍電鏡圖像襯度低的原因是CTF函數的正弦函數取向調制導致圖像低頻部分被衰減,如前面公式(1)和圖2C所示。因此目前用冷凍電鏡解析小分子,尤其是100 kD以下的小分子的高分辨率結構依然是一個挑戰。如果可以通過某種手段使得公式(1)中的相移Φ變為π/2,那么該正弦函數則變為余弦函數CTF(S)=-cos(γ(S)),圖像的低頻部分就不存在衰減,襯度就會顯著增強。近年來相位板(phase plate)技術的出現解決了這個問題[35]。相位板是加在電鏡物鏡后焦面上的一層特殊的薄碳膜,能夠實現這個相移。由于圖像襯度的增強,可以用正焦或者很小的欠焦,甚至小的過焦成像[36],這樣也避免了因為欠焦過大導致的圖像信息的高頻衰減。盡管相位板技術在成像穩定性方面有待進一步提升,但是該技術為目前冷凍電鏡高分辨率三維重構技術突破小分子尺度極限提供了可能。

4.2 埃瓦爾德校正技術是解析超大分子復合體的原子分辨率結構的方向

在冷凍電鏡結構高分辨率解析的另一個極端,如果生物樣品的尺度很大(50 nm以上),要獲得其超過0.3 nm分辨率的結構也很困難。在冷凍電鏡圖像處理時,通常忽略樣品的厚度。如果樣品的厚度小于電鏡的場深,這個近似是合理的。但是如果樣品的厚度過大,必然導致樣品沿著入射電子方向上不同層面的欠焦值不同,從而導致圖像高分辨率信息由于欠焦值差異而混疊?？紤]到這一點,每張樣品顆粒的冷凍電鏡圖像的傅里葉變換就不再是對應于穿過原點的中央截面,而是穿過原點的一個球形曲面,這樣的電鏡圖像校正稱為埃瓦爾德(Ewald)校正[37]。當分辨率要求不高且顆粒尺度很小的時候,該曲面和截面可認為是近似相同的。這就解釋了盡管二十面體病毒樣品是在所有生物樣品中首個獲得0.3～0.4 nm分辨率結構的樣品,但是分辨率很難繼續提高了。由于冷凍電鏡圖像信噪比較低且埃瓦爾德校正算法復雜,目前該校正并沒有被廣泛地應用。要推進較大顆粒的重構分辨率,電鏡圖像的埃瓦爾德校正有待進一步研究。

4.3 某些樣品在溶液中的優勢取向問題有待解決

冷凍電鏡樣品中的優勢取向也會影響重構分辨率。如之前提到的,冷凍電鏡三維重構的一個前提就是需要得到顆粒圖像的空間取向足夠多而且均勻分布。但是有一些樣品在溶液中的空間取向并不均勻,而是在某些取向的顆粒極多,其他取向很少。這種情況嚴重影響最后的重構分辨率。盡管目前解決這類問題有一些可選方案[38],但是這些方案并非對所有樣品都有效,或者會對成像質量產生負面影響。因此，如何克服溶液中生物樣品顆粒的優勢取向是一個值得研究的課題。

4.4 建立若干個冷凍電鏡設備和技術資源集中的共享科研設施是大勢所趨

目前建立一個300 kV的主流冷凍電鏡平臺需要數千萬元人民幣的設備購置開支,冷凍電鏡設備的昂貴的價格和維護成本使得大多數科研單位無法建立這樣的結構解析平臺。而且,并不是所有的生物學家都是冷凍電鏡專家,他們只關注和結構相關的生物樣品的分子機制。冷凍電鏡維護和操作的復雜性也提高了生物學家的結構解析技術門檻。因此，建設若干個科研共享的冷凍電鏡設施顯得尤為重要。冷凍電鏡結構解析的最終發展的趨勢是和X射線晶體學結構解析共享科研平臺一樣,生物學家只要將合適的生物樣品交給結構解析技術平臺,就能得到樣品的高分辨率三維結構。冷凍電鏡結構解析技術的發展必定會讓生物學家更專注于生物學,而不是結構解析技術本身。

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