懷菊花中總黃酮的提取及其抗氧化性研究

李金鳳,劉華敏,谷令彪,隋 博,劉孝寧,宋曉龍,龐會(huì)利,*,秦廣雍

(1.鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院,河南鄭州 450001; 2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001; 3.安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,河南安陽 455000; 4.焦作市云臺(tái)山農(nóng)業(yè)科技有限公司,河南焦作 454350)

懷菊花(HuaijuChrysanthemum)為“四大懷藥”之一,產(chǎn)自河南焦作武陟縣,歷史悠久,是藥用菊花的始祖[1],有良好的清熱祛風(fēng)[2]、抗炎抗菌[3]、平肝明目[2]、解毒[4]、降血脂[5]、降血糖[5]、降血壓[6]、抗病毒[4]、抗氧化[7-8]和抗凝血[7]等功效。

研究表明,菊花的抗氧化活性跟其所含的總黃酮成分有相關(guān)性。孫靜等[3]研究發(fā)現(xiàn),河北香菊中5種黃酮類成分在清除DPPH自由基上呈現(xiàn)出較好的活性,活性順序從高到低為木犀草素、木犀草苷、芹菜素、金合歡蘇、金合歡苷;并且得出河北香菊所具有的抗氧化活性與其所含總黃酮成分清除自由基有關(guān)。孔琪等[9]研究發(fā)現(xiàn),菊花黃酮對(duì)豬油的氧化有顯著的抑制作用,且其抗氧化能力隨著質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增強(qiáng)。Kim等[10]借助DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除系統(tǒng),來研究二咖啡酰奎寧酸的抗氧化作用。

亞臨界水是指在一定壓力下,將水加熱到100 ℃以上、臨界溫度374 ℃以下,仍然保持在液體狀態(tài)的水[11]。在此狀態(tài)下,水的極性、表面張力和黏度均有所降低,對(duì)黃酮類物質(zhì)的溶解能力大大提升[12]。

本研究采用亞臨界水萃取技術(shù),提取了焦作云臺(tái)冰菊中的總黃酮,對(duì)提取過程進(jìn)行了單因素及響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn),并利用可見分光光度計(jì)考察了總黃酮的抗氧化性活性,以期為懷菊花黃酮的提取及應(yīng)用,提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

懷菊花 由河南省焦作市云臺(tái)山農(nóng)業(yè)科技有限公司提供的云臺(tái)冰菊,為2016年收獲并烘干的樣品;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(CAS153-18-4)、DPPH(CAS:1898-66-4) 上海源葉生物科技有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、鄰苯三酚、37%濃鹽酸、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵 分析純,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

DTD-6R型超聲清洗機(jī) 鼎泰生化科技設(shè)備制造有限公司;722型可見分光光度計(jì)、MP5002型電子天平(0.01 g) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;HWCL-1型集熱式恒溫磁力攪拌浴、SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵、R-1001VN型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、WB-2000型水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;EL204型電子天平(實(shí)際分度值0.0001 g) 梅特勒-托力多儀器有限公司;DZKW-4型電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;FX101-3型電子鼓風(fēng)干燥箱 上海樹立儀器儀表有限公司;TG16型臺(tái)式高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司;JR350型多功能輕便型粉碎機(jī) 上海長(zhǎng)沙工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程 懷菊花→挑選→干燥→粉碎→亞臨界水提取→離心→抽濾→減壓濃縮→醇沉→減壓濾過→減壓濃縮→總黃酮提取液→4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

篩選出無霉變、無蟲蛀及無雜質(zhì)的顏色鮮艷的新鮮干菊花,60 ℃干燥60 min,最終含水率為7.9%,用粉碎機(jī)將其粉碎并過40目篩;在利用亞臨界水提取過程中,要注意高溫耐壓瓶不可接觸槽內(nèi)底部、側(cè)壁及溫度傳感器探頭,夾在支架上的溫度傳感器探頭插入溶液中不得少于5 cm,但不能影響攪拌。

1.2.2 總黃酮的提取 將恒溫干燥過的菊花粉碎,過40目篩,稱取2 g菊花粉置于高溫耐壓瓶中,按單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的提取溫度、提取時(shí)間、液固比和磁力攪拌速率進(jìn)行提取。提取結(jié)束后提取液經(jīng)3000 r/min離心10 min,上清液趁熱真空抽濾,棄去濾渣,再減壓濃縮至30 mL,加入4倍體積80%乙醇溶液在4 ℃冰箱醇沉12 h,使多糖充分沉淀,真空抽濾,濾液在45 ℃下減壓濃縮至30 mL,儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中待用[13]。

1.2.3 亞臨界水提取菊花黃酮的單因素實(shí)驗(yàn) 在提取時(shí)間為50 min,液固比為50∶1 mL/g,磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1400 r/min,提取溫度為110、120、130、140、150 ℃條件下進(jìn)行提取;提取結(jié)束后離心除雜、醇沉、減壓濃縮,計(jì)算黃酮提取量。

在提取溫度為130 ℃,液固比為50∶1 mL/g,磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1400 r/min,提取時(shí)間為20、30、40、50、60 min條件下進(jìn)行提取;提取結(jié)束后離心除雜、醇沉、減壓濃縮,計(jì)算黃酮提取量。

在提取溫度為130 ℃,提取時(shí)間為50 min,磁力攪拌轉(zhuǎn)速為1400 r/min,液固比為30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g條件下進(jìn)行提取;提取結(jié)束后離心除雜、醇沉、減壓濃縮,計(jì)算黃酮提取量。

在提取溫度為130 ℃,提取時(shí)間為50 min,液固比為50∶1 mL/g,磁力攪拌轉(zhuǎn)速為200、600、1000、1400、1800 r/min條件下進(jìn)行提取;提取結(jié)束后離心除雜、醇沉、減壓濃縮,計(jì)算黃酮提取量。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)可看出,磁力攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮提取量的影響較小,提取量變化不大,因此選擇提取溫度、提取時(shí)間、液固比為自變量,根據(jù)Design-Expert V8.0.6.1軟件中的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),對(duì)云臺(tái)冰菊中總黃酮類的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levelsTable of Box-Behnken experimental design

1.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)得到的最佳條件進(jìn)行提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次。

1.2.6 總黃酮測(cè)定方法及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品4 mg于10 mL容量瓶中,用60%乙醇溶液稀釋至刻度,搖均,即得濃度為0.4 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取上述溶液0、0.5、1、2、2.5、4 mL于10 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液定容至4 mL,各加5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL,搖勻,放置反應(yīng)6 min,再各加10%硝酸鋁溶液0.4 mL,搖勻,放置6 min,各加4%氫氧化鈉溶液4 mL,用60%乙醇定容至刻度,搖勻,放置15 min,以蒸餾水做空白對(duì)照,利用可見分光光度計(jì)在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度,以質(zhì)量濃度x(mg/mL)為橫坐標(biāo),吸光度y為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1,得到線性回歸方程y=3.8031x+0.0125,R2=0.9961。表明在0～0.16 mg/mL,總黃酮濃度和吸光度的線性良好。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

樣品總黃酮的測(cè)定:取1 mL提取液于50 mL離心管中,稀釋30倍,按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)方法進(jìn)行顯色反應(yīng),測(cè)定吸光度,帶入回歸方程計(jì)算總黃酮量,按下列公式計(jì)算總黃酮提取量:

式(1)

式中:C為稀釋后測(cè)定的提取液濃度(mg/mL);n為稀釋的倍數(shù);V為樣品液的體積(mL);W為樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.7 超氧陰離子的清除率的測(cè)定 利用鄰苯三酚自氧化法來評(píng)定總黃酮清除超氧陰離子的能力[14-15]。

式(2)

式中:A0為加入蒸餾水空白體系的吸光值;Ai為加入樣品液的吸光值;Ai0為不加鄰苯三酚的樣品溶液本底的吸光值。

1.2.8 羥基自由基清除率的測(cè)定 利用鄰菲羅啉法測(cè)定總黃酮清除羥基自由基的能力[16]。

式(3)

式中:A0為空白對(duì)照液的吸光度;Ai為加入樣品溶液的吸光度;Ai0為不加顯色劑H2O2的樣品溶液本底的吸光度。

1.2.9 還原能力的測(cè)定 采用普魯士蘭法測(cè)還原能力[17]。

還原能力的大小ΔA=A-A0

式(4)

式中:A為樣品的吸光值;A0為空白組的吸光值。

1.2.10 DPPH自由基清除率的測(cè)定 利用DPPH自由基法測(cè)定其抗氧化活性[10]。

式(5)

式中:A0為1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值;As為1.0 mL樣液+3.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光值;Ac為1.0 mL樣液+3.0 mL無水乙醇的吸光值。

1.2.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 用Microsoft Excel和Origin 9.0數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性分析,通過軟件Design-Expert 8.0.6得出懷菊花總黃酮提取的最佳條件,并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2 黃酮提取的單因素實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響 提取溫度對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響如圖2所示。

由圖2可以看出,隨著提取溫度的升高,黃酮的提取量不斷增加,在120 ℃達(dá)到最大值(58.157 mg/g),而后提取量呈下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)?在一定范圍內(nèi),提取溫度的提升使得分子運(yùn)動(dòng)加快,溶質(zhì)的傳質(zhì)系數(shù)及擴(kuò)散速度均有所升高,從而有助于黃酮的溶出;然而過高的提取溫度,會(huì)使總黃酮部分分解,多糖和蛋白質(zhì)等非提取成分浸出并形成泡沫,包裹在物料表面,致使提取不充分[18]。

由圖2中的a、b、c可看出,隨著濃度的增加,超氧陰離子自由基與羥基自由基的清除作用、相對(duì)還原能力也逐漸增大,并且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系,分別在120 ℃達(dá)到最大值,這與楊琳琳[19]對(duì)黑心菊花瓣的抗氧化活性研究相一致;圖2d可以看出,在提取溫度120 ℃時(shí)，黃酮提取量最大(58.157 mg/g)，其DPPH自由基清除率(66.7%)低于在提取溫度為130 ℃時(shí)的DPPH自由基清除率(67.8%);隨著黃酮濃度的增加,DPPH自由基的清除率開始有輕微下降。這可能因?yàn)槟承﹥?nèi)源性抗氧化物質(zhì)可能發(fā)生一定降解,因而清除DPPH自由基的能力反而下降。

圖2 提取溫度對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of temperature on extraction yield and antioxidant activity

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響如圖3所示。

圖3 時(shí)間對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield and antioxidant activity

由圖3看出,一定時(shí)間范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的增加,黃酮提取量不斷上升,在提取時(shí)間為40 min時(shí)黃酮量達(dá)到最大值(68.096 mg/g),此后開始緩慢下降。原因可能是在飽和溶液中,時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)增加溶質(zhì)的量;此外,時(shí)間過長(zhǎng)還會(huì)導(dǎo)致黃酮的分解[20]。同時(shí),由圖3可知,在提取時(shí)間為40 min時(shí),超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率、相對(duì)還原能力及DPPH自由基清除率均達(dá)到峰值,分別為89.7%、47.5%、0.962和55.0%,其后隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),黃酮提取量的減少,各指標(biāo)均開始呈不同程度下降趨勢(shì),這可能因?yàn)槟承┛寡趸镔|(zhì)發(fā)生了一定的降解;另外,在一定濃度范圍內(nèi),隨濃度的增加,超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率、相對(duì)還原能力及DPPH自由基清除率均有增大趨勢(shì),并表現(xiàn)出一定的量變效應(yīng),這與楊琳琳[19]對(duì)黑心菊花瓣的抗氧化活性研究相一致。

2.1.3 液固比對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響 液固比對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響如圖4所示。

圖4 液固比對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield and antioxidant activity

由圖4可知,液固比在40∶1 mL/g時(shí),黃酮提取量最大,液固比過高時(shí),一方面增加了提取操作時(shí)的加熱時(shí)間,影響后續(xù)操作;二則會(huì)提取出水溶性多糖和蛋白質(zhì),導(dǎo)致總黃酮溶出受阻[12]。從圖4中的a、b、c、d可以得出,總黃酮類具有一定的抗氧化活性,在液固比為40∶1 mL/g時(shí)，黃酮提取量為68.46 mg/g,達(dá)到最大值,超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率、相對(duì)還原能力及DPPH自由基清除率均達(dá)到最高值,分別為94.07%、49.88%、0.975和73.61%,隨著液固比繼續(xù)增加,黃酮提取量減少,各抗氧化指標(biāo)開始下降。

2.1.4 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響 磁力攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響如圖5所示。

圖5 轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of magnetic stirring speed on extraction yield and antioxidant activity

由圖5可知,磁力攪拌轉(zhuǎn)速在200～1400 r/min時(shí),隨著轉(zhuǎn)速的增加,黃酮的提取量增加,在1400 r/min時(shí)達(dá)到最大值,這可能是因?yàn)樵诖穗A段加大轉(zhuǎn)速能提高混合效果,在1400 r/min下菊花粉末與亞臨界水能迅速混勻,因而可以使提取量達(dá)到最大值;在1400～1800 r/min范圍內(nèi),提取量呈下降趨勢(shì),可能因?yàn)檫^大的轉(zhuǎn)速使提取過程中物料飛濺在耐壓瓶壁上,造成損失,致使提取不充分[21];另外,磁力攪拌轉(zhuǎn)速與抗氧化活性在一定程度上有量效應(yīng),在1400 r/min時(shí),超氧陰離子清除率、羥基自由基清除率、相對(duì)還原能力及DPPH自由基清除率均達(dá)到頂峰,分別為92.62%、47.64%、0.956、57.89%,其后開始下降。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

各因素經(jīng)多元回歸擬合,得到多元回歸方程為Y=-738.50569+9.54039A-0.9438B+6.91147C+0.082109AB+0.058662AC-0.047774BC-0.058136A2-0.084318B2-0.13439C2

式(6)

式(6)中方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值,得出方程代表的拋物面開口朝下,具有極大值點(diǎn),可進(jìn)行優(yōu)化分析[22]。

表3 二次回歸方程模型方差分析Table 3 ANOVA for the quadratic regression model

2.2.2 響應(yīng)曲面圖分析與優(yōu)化 根據(jù)回歸方程,作響應(yīng)曲面圖,考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀,分析提取溫度、液固比、提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響。該模型的3D響應(yīng)面圖及2D輪廓圖如圖6～圖8所示。

圖6 提取溫度和液固比對(duì)黃酮提取量影響的 3D響應(yīng)面圖及2D輪廓圖Fig.6 3D response surface and 2D contours plots of effect of temperature and liquid to solid ratio on flavonoids extraction

圖7 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量影響的 3D響應(yīng)面圖及2D輪廓圖Fig.7 3D response surface and 2D contours plots of effect of temperature and time on flavonoids extraction

圖8 提取時(shí)間和液固比對(duì)黃酮提取量影響的 3D響應(yīng)面圖及2D輪廓圖Fig.8 3D response surface and 2D contours plots of effect of time and liquid to solid ratio on flavonoids extraction

由各圖中3D輪廓圖可看出,響應(yīng)曲面坡度的陡峭度,表示伴隨著影響因素的變化,其相應(yīng)響應(yīng)值的變化情況,響應(yīng)曲面愈陡峭,2個(gè)因素間的交互作用對(duì)黃酮提取量的影響越大。

上述3個(gè)圖中響應(yīng)曲面都較陡峭,說明提取溫度和液固比、提取時(shí)間和提取溫度及提取時(shí)間和液固比之間的交互作用對(duì)黃酮提取量影響較大。

2D輪廓圖的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則不顯著[24]。結(jié)合二次回歸模型方差分析中的p值,比較3組圖可以得出,3個(gè)因素間兩兩交互作用都達(dá)到了較顯著水平。從3個(gè)圖的等高線還可以看出,提取溫度對(duì)黃酮提取量的影響要高于液固比;提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響要高于提取溫度;提取時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響要高于液固比。

比較3D響應(yīng)面圖中最高點(diǎn)和2D輪廓圖可得,在所選范圍內(nèi)有極大值點(diǎn),即響應(yīng)面最高點(diǎn),也是2D輪廓圖最小橢圓的中心點(diǎn)。經(jīng)規(guī)范分析和計(jì)算得較佳反應(yīng)時(shí)提取溫度為130 ℃、液固比為44.63∶1 mL/g、提取時(shí)間為46.17 min,估測(cè)黃酮提取量為71.856 mg/g。

由于實(shí)驗(yàn)條件限制,優(yōu)化最優(yōu)條件為提取溫度130 ℃、液固比44∶1 mL/g、提取時(shí)間46 min,在此條件下實(shí)驗(yàn),得到黃酮提取量為(71.796±0.24) mg/g,這與預(yù)測(cè)值71.806 mg/g接近。

3 結(jié)論

本研究以云臺(tái)冰菊為材料,采用亞臨界水法提取懷菊花中總黃酮,考察了提取時(shí)間、提取溫度、液固比及磁力攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)黃酮提取量及其抗氧化活性的影響,并根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)提取過程進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化,得出了以下結(jié)論:懷菊花中總黃酮的抗氧化活性,在超氧陰離子自由基清除作用、羥基自由基清除作用、相對(duì)還原能力及DPPH自由基清除率上,均表現(xiàn)了一定的量變效應(yīng);懷菊花中黃酮的最佳提取工藝條件為:提取溫度130 ℃、提取時(shí)間46 min、液固比為44∶1 mL/g,此時(shí)菊花中黃酮類物質(zhì)的實(shí)際提取量為71.796 mg/g。本研究較為系統(tǒng)地研究懷菊花中黃酮及其抗氧化功效,為生產(chǎn)實(shí)踐提供參考。

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