山杏內(nèi)種皮磷脂類(lèi)化合物提取工藝研究

紀(jì)麗麗,鮑宇宏,張曉旭,那 娜,于丹梅,韓 雪,劉偉強(qiáng)

(1.黑龍江林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,生態(tài)工程學(xué)院,黑龍江牡丹江 157000; 2.青島黃海學(xué)院,護(hù)理與健康學(xué)院,山東青島 266000)

磷脂是含磷酸基的類(lèi)脂化合物,是組成生物膜的主要成分,是生命的基礎(chǔ)物質(zhì)之一,在生命過(guò)程中起結(jié)構(gòu)形成作用和代謝作用。磷脂具有促進(jìn)脂肪代謝、改善脂質(zhì)代謝和調(diào)節(jié)膜酶活性等生理功能,是具有保健功能的食品添加劑。另外,磷脂具有乳化性,是工業(yè)中重要的表面活性劑和乳化劑[1]。磷脂主要是從動(dòng)物腦組織、禽類(lèi)蛋黃以及油料植物種子中提取[2]。常見(jiàn)磷脂提取方法有溶劑萃取法、超聲波輔助萃取法、微波輔助萃取法、金屬沉淀法、超臨界CO2流體萃取法、膜分離法和酶催化法等,磷脂分析檢測(cè)方法有薄層色譜分離法、柱色譜分離法、高效液相色譜法和核磁共振法等[3]。其中,微波輔助萃取法是基于微波場(chǎng)瞬時(shí)穿透性加熱的原理而應(yīng)用于有效成分提取的方法,該方法使目標(biāo)組分在微波場(chǎng)作用下迅速生成大量的熱能,加速目標(biāo)組分由固體內(nèi)部向固液界面擴(kuò)散的速率[4]。微波輔助萃取技術(shù)具有溶劑用量少、操作時(shí)間短、提取率高等特點(diǎn)[5],廣泛應(yīng)用于多種天然產(chǎn)物的提取[6-7]。

山杏(Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne)在北方地區(qū)分布廣泛,是重要的經(jīng)濟(jì)林和造林樹(shù)種,山杏的開(kāi)發(fā)利用主要有山杏蛋白、山杏油、苦杏仁苷等[8]。種皮是杏仁加工時(shí)產(chǎn)生的下腳料,目前有以山杏種皮為材料提取黑色素[9]、總多酚[10]等化合物的研究,未見(jiàn)有提取磷脂的報(bào)道。本文利用微波輔助萃取法,研究山杏內(nèi)種皮磷脂類(lèi)化合物的提取工藝,并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù),以高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法分離測(cè)定磷脂類(lèi)化合物,為山杏的綜合利用提供技術(shù)指導(dǎo),提高產(chǎn)品的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山杏仁 購(gòu)自牡丹江市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),經(jīng)黑龍江林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院張樹(shù)寶教授鑒定;磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;磷酸二氫鉀、鉬酸銨、抗壞血酸、無(wú)水醋酸鈉、高氯酸 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司;甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇、正己烷 天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);濃硝酸、氯仿 天津市津科精細(xì)化工研究所;液相色譜所用試劑 為色譜純;其他試劑 為分析純。

MCR-3微波化學(xué)反應(yīng)器 上海丞伍儀器科技有限公司;LC-16高效液相色譜儀 日本島津公司;SPD-16檢測(cè)器 日本島津公司;Milli-Q Academic超純水儀 美國(guó)密理博公司;AR1140型電子天平 梅特勒-托利多公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);KQ-500DE型超聲波清洗器 昆山舒美超聲儀器有限公司;T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海普析通用儀器有限公司;TGL16M型高速冷凍離心機(jī) 湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;DGG-9023A電熱恒溫真空干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;HH-S-21-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海精科儀器有限公司;JP-500C粉碎機(jī) 永康市久品工貿(mào)有限公司;D8-XAB電熱板 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制 磷顯色液:鉬酸銨1.25 g,無(wú)水醋酸鈉4.10 g,蒸餾水溶解,定容至500 mL,與10%抗壞血酸水溶液按體積比9∶1混合;消化劑:高氯酸-硝酸體積比1∶4混合液。

1.2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 精密稱(chēng)取磷酸二氫鉀0.0500 g,去離子水溶解,配制成標(biāo)準(zhǔn)磷溶液,此標(biāo)準(zhǔn)溶液中磷濃度為0.2275 mg/mL。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)磷溶液5、10、20、30、40、50 μL,置具刻度試管中,加入0.25 mL消化劑,消化至液體無(wú)色,加入顯色液定容至5 mL,65 ℃水浴顯色10 min,紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于820 nm處,測(cè)定吸光度[11]。以標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X),以吸光度為縱坐標(biāo)(Y),標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=0.1906X+0.0113,線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)為0.9998,磷濃度在0.2275～2.275 μg/mL范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.2.3 總磷脂得率測(cè)定 經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),選擇正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)為萃取試劑。準(zhǔn)確稱(chēng)取山杏內(nèi)種皮粉末1.000 g,置于溶樣杯中,加入一定量的萃取試劑,在一定的萃取溫度下,以一定的微波功率萃取一段時(shí)間。萃取結(jié)束后,6000 r/min離心10 min,上清液定容到25 mL。取5 mL于錐形瓶中,40 ℃水浴蒸干溶劑,另取一只錐形瓶為空白,分別加入10 mL消化液,低溫加熱,待黃煙冒盡后,升高溫度,待溶液澄清時(shí),停止加熱。冷卻至室溫后,分別用顯色液定容至5 mL,65 ℃水浴恒溫10 min,冷卻后以空白調(diào)零,于820 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算測(cè)定樣品中磷的含量,再根據(jù)公式計(jì)算總磷脂得率[12-14]。

總磷脂得率(%)=X×V2×25/(V1×W×106)×100

式中:X為測(cè)定樣品中磷元素質(zhì)量(μg);V1為測(cè)定時(shí)吸取樣品的體積(mL);V2為樣品提取液的總體積(mL);W為樣品的稱(chēng)樣量(g);25為磷轉(zhuǎn)換成磷脂的系數(shù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 從萃取溫度、萃取時(shí)間、微波功率、料液比四個(gè)方面進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察其對(duì)總磷脂得率的影響[15-17]。

1.2.4.1 萃取溫度對(duì)總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波時(shí)間15 min,考察萃取溫度30、35、40、45、50、55 ℃對(duì)總磷脂得率的影響。

1.2.4.2 萃取時(shí)間對(duì)總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波功率300 W,微波溫度45 ℃,考察萃取時(shí)間5、10、15、20、25、30 min對(duì)總磷脂得率的影響。

1.2.4.3 微波功率對(duì)總磷脂得率的影響 料液比1∶20 (g/mL),微波溫度45 ℃,微波時(shí)間15 min,考察微波功率200、300、400、500、600、700 W對(duì)總磷脂得率的影響。

1.2.4.4 料液比對(duì)總磷脂得率的影響 微波功率300 W,微波溫度45 ℃,微波時(shí)間15 min,考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 (g/mL)對(duì)總磷脂得率的影響。

1.2.5 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用L9(34)表作正交實(shí)驗(yàn),考察萃取溫度、微波功率、萃取時(shí)間、料液比4個(gè)因素對(duì)磷脂得率的影響,確定微波輔助萃取山杏內(nèi)種皮磷脂的最佳工藝條件[18]。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.6 磷脂類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱(chēng)取磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、溶血磷脂酰膽堿(LPC)標(biāo)準(zhǔn)品,甲醇溶解并定容,得質(zhì)量濃度為PC:1.6 mg/mL,PE:2.8 mg/mL,PG:1.6 mg/mL,LPC:2.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[19]。

1.2.7 制備磷脂樣品 稱(chēng)取樣品1.000 g,正己烷-乙醇(1∶2,mL/mL)溶液25 mL,在微波溫度45 ℃,微波功率400 W條件下提取15 min,萃取結(jié)束后,6000 r/min離心10 min,取上清液,0.75%氯化鈉溶液萃取2次,收集有機(jī)相,旋轉(zhuǎn)濃縮至近干,甲醇定容至10 mL,取樣品溶液1 mL,甲醇稀釋至10 mL,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,得待測(cè)樣品[20]。

1.2.8 色譜條件 色譜柱為ZORBAX Rx-SIL柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇∶乙腈=85∶15 (mL/mL);等度洗脫;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm[21-23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft excel 2016軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波萃取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 萃取溫度對(duì)總磷脂得率的影響 萃取溫度對(duì)總磷脂得率的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知,溫度升高,分子運(yùn)動(dòng)加速,磷脂類(lèi)化合物的滲透、擴(kuò)散、溶出速度加快,更易從細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到提取試劑中,在50 ℃時(shí)磷脂得率最大,為0.0873%,再升高溫度時(shí),由于磷脂類(lèi)化合物對(duì)熱不穩(wěn)定,磷脂易發(fā)生分解,導(dǎo)致磷脂得率下降。

圖1 萃取溫度對(duì)總磷脂得率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction yield of phospholipids

2.1.2 萃取時(shí)間對(duì)總磷脂得率的影響 萃取時(shí)間對(duì)總磷脂得率的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知,磷脂得率隨萃取時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,當(dāng)萃取時(shí)間為15 min時(shí),磷脂得率有最大值,為0.0821%,再延長(zhǎng)萃取時(shí)間,磷脂得率呈下降趨勢(shì)。在較短時(shí)間內(nèi),微波對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞作用大,磷脂類(lèi)化合物大量溶出,得率提高,而隨著細(xì)胞破碎程度的加大,其他雜質(zhì)的溶出也增加,且受高溫影響,磷脂類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變,磷脂得率降低。

圖2 萃取時(shí)間對(duì)總磷脂得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction yield of phospholipids

2.1.3 微波功率對(duì)總磷脂得率的影響 微波功率對(duì)總磷脂得率的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知,隨著微波功率的增大,磷脂得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢(shì),在400 W時(shí)磷脂得率達(dá)到最大值,為0.0899%。微波功率增大,微波能吸收增多,促進(jìn)細(xì)胞破碎,磷脂類(lèi)化合物溶出增加,但功率過(guò)大,可能破壞磷脂類(lèi)化合物結(jié)構(gòu),導(dǎo)致磷脂降解,得率下降。

圖3 微波功率對(duì)總磷脂得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction yield of phospholipids

2.1.4 料液比對(duì)總磷脂得率的影響 料液比對(duì)總磷脂得率的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知,料液比在1∶10～1∶25 (g/mL)時(shí),磷脂得率升高明顯,而料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)時(shí),磷脂得率增長(zhǎng)趨于緩慢。增大萃取溶劑量,原料浸提充分,磷脂得率增加,而繼續(xù)提高溶劑量,料液質(zhì)量濃度差增幅逐漸降低,磷脂得率的增加也趨于平緩,從提取效果和降低成本方面考慮,料液比1∶25 (g/mL)最佳,此時(shí)磷脂得率為0.0886%。

圖4 料液比對(duì)總磷脂得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction yield of phospholipids

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)磷脂類(lèi)化合物提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,微波輔助萃取山杏內(nèi)種皮磷脂類(lèi)化合物的工藝中,各因素的影響主次順序?yàn)?萃取時(shí)間(B)>微波功率(C)>料液比(D)>萃取溫度(A),最佳工藝組合為A1B2C2D3,即料液比1∶25 (g/mL),萃取溫度45 ℃,微波功率400 W,萃取時(shí)間15 min。在優(yōu)化工藝條件下平行實(shí)驗(yàn)3次,驗(yàn)證工藝參數(shù)。山杏內(nèi)種皮總磷脂得率為0.0977%±0.0015%,磷脂得率高且重復(fù)性好。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

對(duì)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,萃取時(shí)間對(duì)磷脂類(lèi)化合物提取有顯著影響(p<0.05),微波功率、料液比和萃取溫度均未顯示出顯著差異性(p>0.05)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis results of variance

2.3 磷脂類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

分別吸取一定量的各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,甲醇定容得混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按實(shí)驗(yàn)方法中色譜條件進(jìn)行測(cè)定,4種磷脂類(lèi)化合物標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖5所示。由圖5可知,本文建立的方法各標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間較快,峰形較好,基線(xiàn)穩(wěn)定,分離度良好。PG、PE、PC及LPC標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間分別為2.538、3.101、5.885 min及8.118 min。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.5 Chromatograms of a mixed phospholipis standards注：1.PG;2.PE;3.PC;4.LPC。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

分別取各磷脂標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,甲醇稀釋,制成系列標(biāo)準(zhǔn)工作液,按實(shí)驗(yàn)方法中色譜條件進(jìn)行測(cè)定。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度,縱坐標(biāo)為峰面積×106,進(jìn)行線(xiàn)性回歸。以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限。磷脂類(lèi)化合物的線(xiàn)性方程、相關(guān)系數(shù)、測(cè)定范圍及檢出限見(jiàn)表4。由表4可知,各標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)在測(cè)定范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。在信噪比為3∶1時(shí),測(cè)得PE、PC、PG及LPC標(biāo)準(zhǔn)品最低檢測(cè)限分別為2.7、3.8、3.1 μg/mL及4.9 μg/mL。

表4 不同磷脂組分的線(xiàn)性方程Table 4 The linear regression equations of different phospholipids

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

重復(fù)6次測(cè)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,磷脂化合物峰面積的RSD值分別為PC:1.45%,PE:1.27%,PG:1.33%,LPC:0.94%,儀器精密度良好。

2.6 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取一定量的山杏內(nèi)種皮樣品,按樣品制備方法進(jìn)行處理,在實(shí)驗(yàn)方法中的色譜條件下測(cè)定,平行實(shí)驗(yàn)6次,樣品色譜圖如圖6所示。由圖6可知,山杏內(nèi)種皮磷脂中有PE,而PC、PG與LPC未檢測(cè)出。記錄樣品溶液PE的峰面積,取平均值,根據(jù)線(xiàn)性方程計(jì)算山杏內(nèi)種皮PE含量為(0.3936±0.0082) mg/g。

圖6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatograms of sample

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

稱(chēng)取山杏內(nèi)種皮樣品1.000 g置于10 mL容量瓶中,分別加入一定體積的磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液,處理樣品,高效液相色譜測(cè)定含量,結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,PE加樣回收率在95.38%～98.56%之間,加樣回收率和RSD數(shù)據(jù)表明,本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)山杏內(nèi)種皮中PE分析檢測(cè)具有良好的準(zhǔn)確度。

表5 加樣回收率結(jié)果(n=6)Table 5 Spiked recoveries of different phospholipids(n=6)

3 結(jié)論

本文利用微波輔助萃取法提取山杏內(nèi)種皮中磷脂類(lèi)化合物,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化微波輔助萃取條件。最優(yōu)條件為,微波溫度45 ℃,萃取時(shí)間15 min,微波功率400 W,料液比1∶25 (g/mL),測(cè)得山杏內(nèi)種皮總磷脂得率為0.0977%±0.0015%。高效液相色譜法測(cè)的磷脂酰乙醇胺(PE)含量為(0.3936±0.0082) mg/g。本研究對(duì)山杏資源的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

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