N-糖基化對重組木聚糖酶XynA酶學特性的影響

張笑雨,高思宇,李秀婷,楊 然,*

(1.北京工商大學,食品添加劑與配料北京高校工程研究中心,北京 100048; 2.北京工商大學,北京市食品風味化學重點實驗室,北京 100048； 3.北京工商大學,北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京100048)

木聚糖(Xylan)存在于植物細胞壁中,是含量僅次于纖維素的自然界第二豐富的可再生資源[1]。木聚糖酶(Xylanase)作為降解植物細胞壁半纖維素的關鍵水解酶之一,廣泛地存在于細菌、真菌、酵母菌和反芻動物的瘤胃中[2],目前應用于輕工[3]、飼料[4]、能源以及食品工業中[5]。

由于天然菌株表達木聚糖酶難以大規模的生產,且優良性能的酶較少而限制其應用范圍[6],為此越來越多的研究者開始關注重組木聚糖酶的異源表達,如大腸桿菌表達系統、畢赤酵母表達系統等。其中巴斯德畢赤酵母作為高效表達外源蛋白的真核表達系統,具有遺傳穩定,表達高效及對蛋白進行翻譯后加工等優點,已有數百種外源蛋白在該系統中實現表達[7]。同樣畢赤酵母表達體系具有許多真核表達系統所特有的特點,如蛋白酶加工、折疊、二硫鍵形成和糖基化修飾作用等[8],其中N-糖基化修飾是蛋白質主要的翻譯后修飾之一[9],許多蛋白質功能的實現多與糖基化修飾密切相關,如對于許多蛋白質的正確折疊分泌是必需的,同時能夠穩定蛋白質的成熟構象,增加其穩定性等[10]。王茜[11]通過脫糖基化酶Endo H去除重組植酸酶 phy(QF)的糖鏈,發現糖基化的植酸酶與未糖基化的植酸酶相比最適溫度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃,對酶的穩定性有促進作用。Guo[12]研究發現畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃處理10 min可維持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃處理10 min酶活劇烈下降。Chang等[13]的研究也發現去除N-糖基化修飾會降低木聚糖酶酶活和耐熱穩定性,同時也影響了其最適pH。但是,也有文獻報道糖基化修飾不會顯著影響酶的熱穩定性反而會使其熱穩定性降低。雖然已有許多研究者成功的實現了木聚糖酶基因在畢赤酵母中的表達,但是對GH11家族木聚糖酶N-糖基化修飾的研究較少,因此,研究N-糖基化修飾對木聚糖酶在畢赤酵母中表達以及對酶學特性的影響,對進一步改造重組木聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達具有重要意義。

實驗室前期,從一株枝鏈霉菌L2001中克隆得到木聚糖酶基因xynA并在大腸桿菌中實現了克隆與表達,對其發酵條件控制和酶學特性進行了比較系統的研究。筆者通過SignalP 4.1 Server預測木聚糖酶基因xynA含有信號肽,表明其分泌到胞外,有被糖基化修飾的可能,同時通過NetNGlyc 1.0 Server預測,xynA序列中含有5個潛在的N-糖基化位點,而N-糖基化作用可能對重組蛋白的分泌及特性產生影響。因此,本文采用衣霉素處理畢赤酵母細胞,通過對比處理前后木聚糖酶的表達量及酶學特性,初步探究N-糖基化對木聚糖酶的分泌表達及酶學特性的影響,為木聚糖酶的定向改造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α天根生化科技有限公司;重組質粒pET28a-xynA畢赤酵母(PichiapastorisGS115)、表達載體pPIC9K 由實驗室保存;Endo H酶(500000 U/mL)、T4 DNA連接酶(400000 U/mL)、限制性內切酶EcoR I(20000 U/mL)、Not I(20000 U/mL)、SacI(20000 U/mL) NEB公司;LA Taq聚合酶(5 U/mL) TaKaRa公司;衣霉素 上海阿拉丁公司;質粒提取試劑盒及膠回收試劑盒 OMEGA公司;Bradford 蛋白濃度測定試劑盒 北京索萊寶公司;木聚糖及酶活測定相關試劑 Sigma公司;引物合成 由奧科鼎盛公司完成,基因測序于北京華大基因公司完成;LB培養基 氯化鈉1%,胰蛋白胨1%,酵母粉0.5%,固體培養基加2%瓊脂,121 ℃濕熱滅菌20 min;BMGY培養基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、1%甘油；BMMY培養基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、100 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH6.0、1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇；篩選培養基MD 1.34% YNB、4×10-5%生物素、2%葡萄糖、2%瓊脂；篩選培養基MM 1.34% YNB、4×10-5%生物素、0.5%甲醇、2%瓊脂；YPD培養基 1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖，固體培養基加2%瓊脂(參考www.invitrogen.com網站的操作手冊)。

T100-Thermal cycler PCR儀、Gene Pulser XcellTM電穿孔系統 美國 BIO-RAD公司;EPS301 瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠;Microfuge 20R臺式微量離心機 德國 Beckman 公司;ImageQuant 300凝膠成像儀、Multitemp Ⅲ恒溫循環水浴器 美國GE 公司;HR60-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司;恒溫培養箱 上海 STIK 公司;DHZ-DA 大容量全溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設備廠;YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組表達質粒pPIC9K-xynA的構建 以重組質粒pET28a-xynA為模板,設計含EcoR I、Not I的上下游引物(xynA-F01:5′-CGGAATTCACGGTC GTCACCACG-3′;xynA-R02:5′-ATAAGAATGC GGCCGCTCACGACGACACCGTG-3′),經PCR擴增出不含信號肽的基因序列xynA[14],PCR擴增條件為:94 ℃ 2 min預變性;94 ℃ 30 s變性;61 ℃ 30 s退火;72 ℃ 1 min延伸,進行30個循環;72 ℃ 10 min延伸。分別對目的基因xynA和真核表達載體pPIC9K進行雙酶切并回收,于24 ℃連接2.5 h、轉化至大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態細胞中,通過重組質粒pPIC9K-xynA的DNA測序確認構建成功[15]。

1.2.2 重組畢赤酵母的構建及高拷貝轉化子的篩選 將測序成功的pPIC9K-xynA重組質粒經SacI 限制性內切酶線性化后,電擊轉化至畢赤酵母感受態細胞中,涂布于MD平板上30 ℃培養直至長出菌落,菌落PCR驗證陽性轉化子,挑取轉化子接種含有不同濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、6.0 mg/mL)G418的YPD平板,30 ℃培養3～5 d,篩選出的高拷貝轉化子,經搖瓶復篩后,最終獲得一株重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-xynA[16]。畢赤酵母感受態細胞的制備:挑取畢赤酵母GS115單菌落接種于5 mL YPD液體培養基中,30 ℃搖床過夜;以1%接種量轉接100 mL YPD液體培養基,30 ℃搖床過夜至OD=1.3～1.5;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用100 mL冰預冷無菌水重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用50 mL冰預冷無菌水重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,用4 mL冰預冷的1 mol/L山梨醇重懸菌體;4 ℃,5000 r/min離心5 min棄上清,菌體用0.2 mL 1 mol/L山梨醇重懸并轉移至新的無菌1.5 mL離心管中備用(感受態細胞需現用現制)。電擊轉化方法:在80 μL酵母感受態細胞中加入1～5 μg線性化的質粒輕柔混勻轉移至0.2 cm冰預冷的電擊杯于冰上放置5 min,設置電擊參數為1.5 kV、25 μF、400 Ω,電擊并迅速加入1 mL 1 mol/L山梨醇,涂布MD平板(參考www.invitrogen.com網站的操作手冊)。

1.2.3 重組木聚糖酶XynA的誘導表達 將驗證成功的陽性轉化子接種于50 mL BMGY培養基中，于29 ℃,250 r/min條件下富集培養48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min離心收集菌體,于無菌條件下重懸于50 mL BMMY培養基中誘導表達,每隔24 h取樣并添加終濃度為1%的甲醇誘導表達,培養8 d后,發酵液4 ℃,8000 r/min離心5 min,取上清即為粗酶液。

1.2.4 衣霉素抑制畢赤酵母細胞誘導表達重組木聚糖酶XynA 將驗證成功的陽性轉化子接種于50 mL BMGY培養基中，于29 ℃,250 r/min條件下富集培養48 h,4 ℃,5000 r/min,5 min離心收集菌體,于無菌條件下重懸于50 mL 含不同濃度衣霉素(2、5、10、15 μg/mL)BMMY培養基中誘導培養8 d,發酵液4 ℃,8000 r/min離心5 min,取上清即為粗酶液,以同樣培養的未加衣霉素培養的菌株為對照[17]。

1.2.5 內切糖苷酶Endo H處理重組木聚糖酶XynA 在20 μg重組木聚糖酶中加入1 μL 10×糖蛋白變性緩沖液,補入滅菌高純水至總體積為10 μL;于100 ℃反應10 min;加入2 μL 10×GlycoBuffer 3緩沖液,1 μL Endo H酶,7 μL無菌水至反應總體積為20 μL,在37 ℃下溫育1.5 h。將反應后產物進行SDS-PAGE檢測。

1.2.6 SDS-PAGE與PAS糖染色分析 SDS-PAGE 按照Laemmli[18]的方法進行,濃縮膠濃度5.0%,分離膠濃度為10.0%,上樣量20 μL,電泳結束后,用考馬斯亮藍染色15 min后脫色。PAS糖染色[19]:取出SDS-PAGE后的凝膠,將其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1 h以固定蛋白條帶;然后將固定后的凝膠取出用5%的冰醋酸清洗2次,每次10 min;然后把凝膠浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中,于4 ℃中黑暗條件下氧化1 h;用5%冰醋酸將凝膠漂洗幾次后,用50 mL的偏重亞硫酸鈉溶液(0.2 g偏重亞硫酸鈉溶于100 mL 5%冰醋酸),浸泡10 min;用Schiff試劑于4 ℃中避光染色1 h;染色完畢后將凝膠用大量5%冰醋酸進行清洗,即可見紅色糖蛋白電泳條帶。

1.2.7 木聚糖酶活力測定 木聚糖酶活力測定參考Miller GL[20]的DNS法。以1 mg/mL的木糖為標準樣品繪制標準曲線,根據標準曲線與540 nm處的吸光值計算所得還原糖的量。木聚糖酶的活力單位(U)定義為:在上述條件下,每分鐘水解木聚糖生成1 μmol還原糖(木糖)所需要的酶量。

1.2.8 抑制糖基化前后木聚糖酶酶學特性分析

1.2.8.1 pH對重組木聚糖酶活力的影響 采用實驗室緩沖體系:甘氨酸(Gly)-鹽酸 pH2.0～3.0;檸檬酸-檸檬酸三鈉(Citrate)pH3.0～6.0;磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉pH6.0～8.0;Tris-鹽酸 pH8.0～9.0;甘氨酸(Gly)-氫氧化鈉pH9.0～10.0緩沖液調整酶液,使酶液處于不同的緩沖條件,按照方法1.2.7中酶活測定方法測定酶活力;穩定性的測定,使酶液處于不同緩沖液下,50 ℃下保溫30 min,立即冰水浴終止反應,然后按照方法1.2.7中酶活測定方法測定剩余酶活力,以未經保溫處理的酶液的木聚糖酶活力為100%對照。

1.2.8.2 溫度對重組木聚糖酶活力的影響 將酶液用最適pH緩沖液適當稀釋,然后分別在不同溫度條件下(40、45、50、55、60、65、70、75、80、85 ℃)下反應,測定木聚糖酶活力,以最大值為100%,確定最適反應溫度;用最適pH緩沖液對酶液按照酶液比緩沖液1∶5進行適當稀釋,分別在40～85 ℃(相鄰溫度間隔5 ℃)的不同溫度條件下保溫處理30 min,保溫結束后立即冰浴冷卻,然后按照方法1.2.7中酶活測定方法測定木聚糖酶的剩余酶活力,以未經保溫處理的酶液的酶活力作為100%對照[14]。

1.2.8.3 離子濃度及螯合劑對木聚糖酶活性的影響 根據方法1.2.7酶活力的測定方法,考察最終濃度為10 mmol/L的金屬離子、螯合劑(EDTA)對酶活力的影響。以不添加任何金屬離子、鰲合劑的酶液作對照,每個反應設置3個平行。金屬離子包括 Na+、K+、Li+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+、Al3+、Fe3+。

1.2.8.4 胃蛋白酶和胰蛋白酶對木聚糖酶活力的影響 用相應的pH2.0的 0.1 mol/L Gly-HCl和pH7.5的0.1 mol/L Tris-HCl 分別稀釋胃蛋白酶和胰蛋白酶液,蛋白酶的終濃度為0.1 mg/mL,在最適溫度和最適pH下考察酶活力,以未處理的木聚糖酶作為對照,每個反應設置3個平行,考察蛋白酶對酶活力的影響[21]。

1.3 數據處理

數據統計分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和兩因素重復測量數據方差分析(two-way repeated-measures ANOVA)方法,采用SPSS軟件。所有酶活和相對酶活數據從三個獨立實驗或平行所得,采用Excel繪圖。

2 結果與分析

2.1 重組表達質粒pPIC9K-xynA的構建

以重組質粒pET28a-xynA為模板,以xynA-F01、xynA-R02為引物進行PCR擴增后得到線性的目的片段xynA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖1所示,目的基因片段大小為574 bp。目的基因純化后與pPIC9K表達載體雙酶切、連接,轉化E.coliDH5α感受態細胞,陽性克隆子篩選后,提取質粒經PCR驗證(圖2),最后經測序檢驗重組表達質粒pPIC9K-xynA(圖3)構建成功。

圖1 目的片段xynAFig.1 Target gene xynA注:M為Marker;泳道1、2為PCR產物。

圖2 菌落PCRFig.2 Colony PCR注:M為Marker;泳道1～3為菌落PCR產物。

圖3 重組表達質粒pPIC9K-xynA示意圖Fig.3 Sketch map of recombinant expression plasmid of pPIC9K-xynA

2.2 重組畢赤酵母的構建及高拷貝轉化子的篩選

重組表達載體pPIC9K-xynA經SacI 線性化后,電擊轉化至畢赤酵母感受態細胞中,涂布于MD平板(圖4A),挑取轉化子分別點種于含不同濃度 G418的YPD平板,初篩確定G418濃度為6.0 mg/mL,經搖瓶復篩,最終篩選到一株木聚糖酶表達量較高的工程菌株GS115/pPIC9K-xynA(如圖4B中標記4;另外,2,3為表達量較低的工程菌)。

圖4 MD平板上生長的轉化子(A)及G418篩選結果(B)Fig.4 The transformants on the MD medium and the screening results

2.3 重組木聚糖酶的誘導表達及衣霉素處理酵母細胞

衣霉素是一種常見的糖基化抑制劑,能在細胞內抑制畢赤酵母表達蛋白的糖基化修飾,且其并不影響酵母細胞的生長[17],因此在培養基中加入衣霉素培養后,能夠使原來發生糖基化的蛋白去糖基化。隨著誘導時間的增加,菌體OD600也逐漸升高(圖5),第7 d時開始下降,這是由于培養基中營養成分消耗影響了酵母生長,但是添加衣霉素組與未添加衣霉素組的酵母生長情況大體一致,因此衣霉素的添加并未影響畢赤酵母工程菌的正常生長。

圖5 添加不同濃度衣霉素對于酵母菌體生長的影響Fig.5 Influence of yeast growth by adding different concentration of tunicamycin

衣霉素對重組木聚糖酶表達效果的影響如圖6所示,重組木聚糖酶酶活隨著誘導時間的增加呈逐步上升的趨勢,但隨著衣霉素添加濃度增高酶活有所下降,即不同程度抑制N-糖基化修飾的酵母菌分泌的木聚糖酶酶活與未添加組相比均有所下降,其中添加量為10、15 μg/mL分泌的重組酶酶活下降幅度比較大,剩余酶活力分別為82.35%、53.60%,而2、5 μg/mL相比酶活下降幅度不大,僅為0.92%和6.85%,造成酶活降低的原因可能是因為糖基化修飾可以使蛋白質的正確折疊分泌而維持其功能,如果糖基化受到抑制,則不能實現應有的功能狀態[22-23]。

圖6 不同濃度衣霉素對于XynA活力的影響Fig.6 The activity of XynA after treated with different concentration of tunicamycin

采用SDS-PAGE分析誘導培養第8 d衣霉素添加對重組木聚糖酶表達的影響,結果如圖7所示。泳道1～5均在45、35 kDa左右有條帶,且條帶逐漸變窄,當衣霉素添加量為5、10、15 μg/mL(即泳道3、4、5)時25～35 kDa的條帶逐漸變亮,主條帶變暗,經去糖基酶Endo H處理后可見在25 kDa左右出現條帶,表明隨著衣霉素添加量的增加,重組木聚糖酶N-糖基化的程度逐漸降低,但并未完全去除,接近編碼該木聚糖酶基因推測的結果24.0 kDa。這可能是因為畢赤酵母分泌的蛋白大多數為N-連接糖基化高甘露糖型,蛋白轉錄后會一定程度上增加寡糖鏈長度。而增加的長度約為平均每個支鏈8～14個甘露糖殘基,即去N-糖基化修飾后分子量約降低1～3 kDa[24]。由于N-糖基化動態的發生在內質網和高爾基體,蛋白質逐漸折疊成熟,這個過程中受到N-糖基化抑制劑衣霉素的影響,不僅添加糖鏈的大小不同,而且還會影響到糖鏈添加到蛋白質上的位置,已有報道稱N-糖基化發生的程度不僅和糖鏈大小有關還與連接位置有密切關系,并且對蛋白質的功能結構及活性帶來影響[9,25]。

圖7 添加不同濃度衣霉素的XynA粗酶液的電泳圖Fig.7 SDS-PAGE of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin

如圖8所示,經過對粗酶液進行PAS糖染色分析,糖原染色后糖基化蛋白呈現紫紅色條帶,可看出添加不同濃度衣霉素對木聚糖酶N-糖基化的抑制程度不同,隨著衣霉素添加量的增加重組木聚糖酶的抑制程度越高,位于45 kDa的主條帶紫紅色變淺,而低于45 kDa的紫紅色條帶逐漸增多,但是衣霉素的添加并不能完全抑制糖鏈連接到蛋白上以至存在不同程度的N-糖基化。

圖8 添加不同濃度衣霉素的XynA粗酶液的糖染色電泳圖Fig.8 PAS of rude XynA treated with different concentration of tunicamycin注:M為低分子質量蛋白質Marker;泳道1～5：GS115/ pPIC9K-xynA衣霉素添加量分別為0、2、5、10、15 μg/mL。

2.4 抑制糖基化前后木聚糖酶酶學特性分析

2.4.1 pH對重組木聚糖酶活力的影響 由圖9可知,GS115/pPIC9K-xynA最適反應pH為5.0,于pH3.5～5.0之間可保持40%以上的相對酶活力,在pH7.5～10.0時相對酶活不足10%,本實驗木聚糖酶基因來源于枝鏈霉菌L2001,天然菌株表達兩種分子量的木聚糖酶XynA和XynB,其中木聚糖酶XynA木聚糖酶在偏酸性的pH下(即pH5.0～7.0)比較穩定,相對酶活力都保持在60%以上[26],綜上結果,重組木聚糖酶GS115/pPIC9K-xynA并不適合堿性環境;而添加不同濃度衣霉素的木聚糖酶最適反應pH并未發生改變仍為5.0,酶的最適pH受到蛋白質微環境以及氨基酸相互作用的多重影響[27],衣霉素抑制N-糖基化可能并沒有引起木聚糖酶催化殘基pKa值的改變，因此最適pH并沒有發生改變;但其相對酶活力在pH2.0～5.0之間隨著衣霉素添加量的增加而有所降低,這可能是由于抑制N-糖基化后木聚糖酶的酶活力降低而引起的。

圖9 不同濃度衣霉素對XynA最適pH的影響Fig.9 The optimal pH of XynA treated with different concentration of tunicamycin

由圖10可知,添加不同濃度衣霉素的重組木聚糖酶在pH2.5～10.0范圍內相對酶活力均能保留50%及以上,具有較好的穩定性;由于不同緩沖體系的緩沖能力有一定的范圍,同一pH不同緩沖體系的緩沖能力不同,對木聚糖酶的酶活力和穩定性產生了一定的影響。因此,N-糖基化對重組木聚糖酶XynA在不同pH下的活力和蛋白穩定性無明顯影響。

圖10 不同濃度衣霉素對XynA pH耐受力的影響Fig.10 Tolerance of XynA under different pH buffers from 2.0 to 10.0 treated with different concentration of tunicamycin

2.4.2 溫度對重組木聚糖酶活力的影響 由圖11可知,XynA的最適反應溫度為65 ℃,并且在50～75 ℃間可保持50%以上的相對酶活力,經測定XynA在最適反應溫度65 ℃時酶活為406.6 U/mL;添加不同濃度的衣霉素時,重組木聚糖酶最適反應溫度均下降為60 ℃,與未添加組相比,添加衣霉素的木聚糖酶最適反應溫度和比酶活均有所降低,且隨著添加量的增加下降更加明顯。這一結果表明N-糖鏈的修飾作用對木聚糖酶的空間結構產生了一定的影響,進而影響了酶分子對溫度的耐受性。王茜[11]通過脫糖基化酶Endo H去除重組植酸酶phy(QF)的糖鏈,發現糖基化的植酸酶與未糖基化的植酸酶相比最適溫度提高了5 ℃,Tm值提升2 ℃。因此,N-糖基化對XynA在不同溫度下的活力有明顯影響。

圖11 不同濃度衣霉素對XynA最適溫度的影響Fig.11 The optimal temperature of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.3 重組木聚糖酶的熱穩定性 由圖12可知,在低于55 ℃時,重組木聚糖酶XynA的相對酶活可以保持在35%以上,但隨著溫度的增加,穩定性逐漸降低,在65～75 ℃時,重組木聚糖酶XynA的相對酶活力不足5%,在80 ℃以上則可保留10%左右,而且衣霉素的添加也會降低酶的溫度穩定性,但并不明顯。Guo[12]研究發現畢赤酵母重組肌醇六磷酸酶在90 ℃處理10 min可維持40%的酶活,而去糖基化后在40 ℃處理10 min酶活劇烈下降。柯濤[28]等在Pichia pastoris GS115中表達嗜熱酸性α-淀粉酶BD5088,發現糖基化修飾后的酶在100 ℃條件下熱處理1 h仍具有80%以上的酶活力、最適反應溫度由80 ℃增加到90 ℃。Guo[29]等發現N-糖基化可增加抗胰蛋白對于熱的穩定性。

圖12 不同濃度衣霉素對XynA耐熱穩定性的影響Fig.12 Thermal stability of XynA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.4 離子濃度及螯合劑對木聚糖酶活性的影響 如圖13所示,金屬離子Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+對重組木聚糖酶XynA有一定的激活作用;Cu2+及螯合劑EDTA對酶具有一定的抑制作用,其中Cu2+影響最明顯,酶活僅殘留23%;添加不同濃度衣霉素的重組木聚糖酶則表現出與未添加不同的結果,Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA同樣具有一定激活作用,但并未隨著衣霉素濃度的增加而逐漸增強,Ba2+則表現出一定抑制作用,且隨著衣霉素濃度的升高而逐漸降低。推測是因為基于酶蛋白的二級、三級結構,多肽的折疊纏繞肽鏈中的氨基酸殘基的一定側鏈就以一定的幾何形式配置在金屬離子周圍,由于暴露的氨基酸殘基數目和位置不同,所以與金屬離子的結合形式也不同,衣霉素的添加會導致酶在內質網及高爾基體中翻譯后折疊過程中糖鏈不能很好地結合在Asn殘基上,從而對酶的分子結構產生了影響,導致酶與離子結合部位的幾何形式發生變化,最終導致酶分子耐受離子能力改變[30]。

圖13 不同濃度衣霉素對XynA 耐受金屬離子及EDTA的影響Fig.13 Tolerance of XynA under different metal ions and EDTA treated with different concentration of tunicamycin

2.4.5 胃蛋白酶和胰蛋白酶對木聚糖酶活力的影響 由圖14所示,重組木聚糖酶XynA對胰蛋白酶和胃蛋白酶的耐受力有所不同,對胰蛋白的耐受力要好于胃蛋白酶,衣霉素添加量為0、2、5、10 μg/mL時胰蛋白酶對酶活力影響較小,而添加量為15 μg/mL時,酶活損失24%;而胃蛋白酶對木聚糖酶活力的抑制隨著衣霉素添加量的增加而減小,當添加量為5、10、15 μg/mL時剩余酶活力分別為64%、63%、64%,基本無明顯差異,仍能保留50%以上。蛋白質表面的糖鏈還可覆蓋蛋白質分子中的某些蛋白酶降解位點,從而增加蛋白質對于蛋白酶的抗性[31],同時還可以防止蛋白質的相互聚集[32]。

圖14 不同濃度衣霉素對XynA 耐受胃蛋白酶及胰蛋白酶的影響Fig.14 Tolerance of XynA under Pepsin and Trypsin treated with different concentration of tunicamycin

3 結論

本實驗通過在畢赤酵母誘導表達階段添加不同濃度N-糖基化抑制劑——衣霉素,來考察N-糖基化對木聚糖酶分泌表達、酶學特性的影響。經不同濃度衣霉素的作用,對菌株畢赤酵母的生長基本無影響,但隨著衣霉素添加量的增加木聚糖酶酶活力逐漸降低,主條帶逐漸變淺,說明N-糖基化修飾對木聚糖酶正確折疊分泌表達有著重要的作用;衣霉素的添加并未對最適反應pH和pH穩定性產生影響,最適反應pH為5.0,于pH3.5～5.0之間可保持40%以上的相對酶活力;而最適反應溫度在衣霉素添加量大于2 μg/mL時下降了5 ℃,且溫度穩定性也有所下降;較未添加衣霉素組,不同濃度衣霉素添加組中Na+、K+、Li+、Ca2+、Al3+、EDTA具有一定激活作用,Ba2+具有抑制作用;衣霉素的添加抑制了木聚糖酶上N-糖鏈的正常附著,抗蛋白酶水解的能力有所下降。以上結果表明,N-糖基化修飾有利于提高木聚糖酶XynA的分泌表達量,且對酶的熱穩定性有積極作用。

[1]范光森. 樟絨枝霉耐熱木聚糖酶的純化、性質和應用研究[D].北京:中國農業大學,2014.

[2]林小洪,林娟,王國增,等. 海洋來源芽孢桿菌產木聚糖酶的條件研究[J]. 中國食品學報,2015,11:83-90.

[3]高秋芳,陽辛鳳,孔華,等. 果膠裂解酶和木聚糖酶雙價工程菌在菠蘿葉纖維脫膠中的應用[J]. 江蘇紡織a版,2010(3):42-43.

[4]魏川子,王兆斌,李燕蒙,等. 半纖維素酶在畜禽飼料中的應用及研究進展[J]. 畜牧與飼料科學,2015(12):44-46.

[5]閔兆升,郭會明,顧承真,等. 木聚糖酶及其在食品工業中的應用[J]. 食品與發酵工業,2013(10):168-173.

[6]張紅蓮. 橄欖綠鏈霉菌StreptomycesolivaceoviridisA1所產木聚糖酶的純化、酶基因的克隆及表達[D]. 北京:中國農業科學院,2002.

[7]Potvin G,Ahmad A,Zhang Z. Bioprocess engineering aspects of heterologous protein production in Pichia pastoris:A review[J]. Biochemical Engineering Journal,2012,64:91-105.

[8]龍晶,杜立新. 巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的研究進展[J]. 微生物學雜志,2007(6):72-76.

[9]Jayaprakash N G,Surolia A. Role of glycosylation in nucleating protein folding and stability[J]. Biochemical Journal,2017,474(14):2333-2347.

[10]石玉梅,鄭磊,李娟. 糖基化對蛋白質穩定性的影響研究進展[J]. 現代生物醫學進展,2011,(S2):5190-5192.

[11]王茜,宋瑪麗,杜軍,等. N-糖基化對植酸酶phy(Q_F)酶學性質的影響[J]. 華北農學報,2015(1):177-181.

[12]GUO Mei-jin,HANG Hai-feng,ZHU Tai-cheng,et al. Effect of glycosylation on biochemical characterization of recombinant phytase expressed in Pichia pastoris[J]. Enzyme Microbial Technology,2008,42(4):340-345.

[13]Chang X,Xu B,Bai Y,et al. Role of N-linked glycosylation in the enzymatic properties of a thermophilic GH 10 xylanase from Aspergillus fumigatus expressed in Pichia pastoris[J]. PloS one,2017,12(2):e0171111.

[14]熊科,楊玉煥,閆子祥,等. 堿性木聚糖酶在畢赤酵母的表達及酶學性質研究[J]. 食品與發酵工業,2015(3):33-38.

[15]周晨妍,劉振華,王丹丹,等.產木聚糖酶畢赤酵母工程菌株構建及表達條件優化研究[J].食品工業科技,2016,37(13):162-167.

[16]Zhang H M,Wang J Q,Wu M C,et al. Optimized expression,purification and characterization of a family 11 xylanase(AuXyn11A)from Aspergillus usamii E001 in Pichia pastoris[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2014,94(4):699-706.

[17]楊敏,喻曉蔚,吳厚軍,等.畢赤酵母分泌表達華根霉脂肪酶(r27RCLC)的糖基化鑒定[J].食品與生物技術學報,2014,33(10):1018-1024.

[18]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. nature,1970,227(5259):680-685.

[19]樊艷爽.β-葡萄糖醛酸苷酶的N-糖基化設計及熱穩定性研究[D]. 北京:北京理工大學,2015.

[20]Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sμgar[J]. Analytical Chemistry,1959,31(3):426-428.

[21]邱瑾. 兩種木聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達及最適pH的關鍵點研究[D]. 上海:上海海洋大學,2016.

[22]Tian B,Chen Y,Ding S. A combined approach for improving alkaline acetyl xylan esterase production inPichiapastoris,and effects of glycosylation on enzyme secretion,activity and stability[J]. Protein Expression and Purification,2012,85(1):44-50.

[23]Shirke A N,Basore D,Holton S,et al. Influence of surface charge,binding site residues and glycosylation onThielaviaterrestriscutinase biochemical characteristics[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(10):4435-4446.

[24]Macauley-Patrick S,Fazenda M L,McNeil B,et al. Heterologous protein production using thePichiapastorisexpression system[J]. Yeast,2005,22(4):249-270.

[25]Fonseca-Maldonado R,Vieira D S,Alponti J S,et al. Engineering the pattern of protein glycosylation modulates the thermostability of a GH11 xylanase[J]. Journal of Biological Chemistry,2013,288(35):25522-25534.

[26]佘元莉. 枝鏈霉菌L2001的鑒定及其木聚糖酶性質的研究[D].北京:北京工商大學,2010.

[27]羅漫杰. 嗜熱酶高效表達及基于序列統計分析的酶pH適應性研究[D]. 上海:上海交通大學,2015.

[28]柯濤,熊藍,張乃群,等. 合成嗜熱酸性淀粉酶的畢赤酵母表達[J]. 食品與發酵工業,2012(1):30-35.

[29]Guo C,Liu Y,Yu H,et al. A novel strategy for thermostability improvement of trypsin based on N-glycosylation within the Ω-loop region[J]. J. Microbiol Biotechnol,2016,26(7):1163-1172.

[30]王健. 金屬離子對酶功能所起的作用[J]. 宜賓師專學報,1993(2):65-71.

[31]趙洪亮,劉志敏. 蛋白質糖基化工程[J]. 中國生物工程雜志,2003(9):18-20.

[32]Suzuki S,Furuhashi M,Sμganuma N. Additional N-glycosylation at Asn 13 rescues the human LHβ-subunit from disulfide-linked aggregation[J]. Molecular and Cellular Endocrinology,2000,160(1):157-163.