戊糖片球菌NCU301對豆粕強化發酵工藝優化及營養成分的測定

王 浩,熊 濤,彭 珍,關倩倩,肖陽生

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047)

抗生素被批準作為飼料添加劑以來,以其能有效地促進畜禽生長和提高飼料的利用率等優點在全球范圍內得到了廣泛的應用,但同時也帶來了藥物殘留和抗藥性等一系列嚴峻的社會問題[1-2],尋找抗生素替代品已成為當務之急,開發綠色、高效、安全的飼料添加劑是發展現代畜牧業的基礎[3]。目前抗生素替代品主要有益生菌、益生元、酸化劑、酶制劑、中草藥飼料添加劑等[4]。其中益生菌具有抑制動物腸道病原菌的生長、提高動物的免疫力及生產性能等優點,現已成為飼料添加劑的研究熱點[5-6]。

豆粕作為大豆的副產品,蛋白含量高、氨基酸組成合理,是一種廉價優質的植物性蛋白飼料[7]。但豆粕中含有多種抗營養因子,這些抗營養因子不僅會降低豆粕的利用率,還會影響動物對豆粕營養成分的消化、吸收、代謝,造成動物免疫力下降和生產性能降低等問題[7]。采用益生菌發酵豆粕不僅可以降低豆粕中的抗營養因子還能夠提高豆粕中營養成分利用率[8-10]。陳中平[11]采用米曲霉固態發酵豆粕,發酵后豆粕中小肽和氨基酸總量分別提高260.23%和634.62%;吳勝華等[12]利用酵母菌固態發酵豆粕,發酵后豆粕中的胰蛋白酶抑制因子降解率達56.2%;史艷麗等[13]采用枯草芽孢桿菌固態發酵豆粕,結果表明發酵后豆粕中抗原蛋白殘留率僅為5.9%。乳酸菌也是一類可作為飼料添加劑的益生菌,目前的報道多集中在采用乳酸桿菌作為發酵菌株,鄭裴采用植物乳桿菌固態發酵豆粕(滅菌),結果表明植物乳桿菌能夠顯著降低豆粕中的脲酶活性,然而關于采用乳酸片球菌強化發酵豆粕的研究還鮮有報道[14-16]。

本實驗以實驗室前期篩選保藏的益生菌株-戊糖片球菌NCU301作為強化發酵菌株,對未滅菌的豆粕進行接種強化發酵,以乳酸菌總活菌數作為指標,研究發酵時間、發酵溫度、料水比、接種量等因素對乳酸菌總活菌數的影響,同時測定豆粕經接種發酵和自然發酵后的營養成分及抗營養因子的變化,旨在確定發酵豆粕的最佳工藝條件,以期為生產實踐中豆粕的發酵提供理論支撐和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戊糖片球菌NCU301(PediococcuspentosaceusNCU301) 由南昌大學食品科學與工程國家重點實驗室保藏;二級豆粕(含氮量43%) 市售;牛胰蛋白酶 美國Amresco公司;鹽酸、氫氧化鈉、二甲基亞砜、CaCl2、尿素、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、K2SO4,NaCl,CuSO4、H2SO4、硼酸等 均為分析純;MRS液體培養基;MRS固體培養基按照文獻[17]中的方法配制。

Airtech生物安全柜 蘇凈集團安泰公司;DNP-9272型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;ME204E電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DHG-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;K9840型自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;S433D-全自動氨基酸分析儀 賽卡姆科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 自然發酵工藝 稱取未滅菌的豆粕50 g,加入50 mL去離子水,攪拌混勻,置于30 ℃恒溫培養箱固態發酵50 h。

1.2.2 菌種活化及發酵 將保藏在甘油管的菌種以2%的接種量種接入MRS液體培養基,37 ℃恒溫培養24 h,活化兩次。將活化好的菌種按10%的接種量接種到一定料水比的50 g豆粕基礎培養基中,在37℃下發酵48 h,發酵結束后測定乳酸菌總活菌量。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發酵時間 以50 g豆粕作為基礎培養基,料水比1∶1,接種量10%(8.60～8.69 lg(CFU/g)),培養溫度37 ℃,分別發酵24、36、48、60、72 h。

1.2.3.2 發酵溫度 以50 g豆粕作為基礎培養基,料水比1∶1,接種量10%,分別在27、32、37、42、47 ℃下恒溫發酵48 h。

1.2.3.3 料水比 以50 g豆粕作為基礎培養基,接種量10%,培養溫度37 ℃,分別設定1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶1.2的料水比發酵48 h。

1.2.3.4 接種量 以50 g豆粕作為基礎培養基,料水比1∶1,培養溫度37 ℃,分別以4%、6%、8%、10%、12%的接種量進行發酵48 h。

1.2.4 響應面實驗 根據單因素實驗結果,選取對乳酸菌總活菌量影響較大因素,以乳酸菌總活菌量為響應值,應用design-expert8.0.6的Box-Behnken設計3因素3水平的實驗方案。以確定各因素對發酵豆粕中乳酸菌總活菌量影響的顯著性和發酵條件的最優組合,實驗設計的因子編碼及各自變量水平見表1。

表1 響應面因素水平及編碼Table 1 Codes and levels of response surface

1.2.5 測定乳酸菌活菌量 乳酸菌活菌數測定:稱取1 g樣品溶于9 mL無菌生理鹽水中,振蕩混勻,梯度稀釋至適當的倍數,涂布于MRS固體培養基上,37 ℃恒溫培養24 h,計數。

1.2.6 營養成分及抗營養因子檢測 粗蛋白含量測定:采用國標《GB/T6432-1994》[18];酸溶性蛋白含量測定:采用國標《GB/T22492-2008》[19];游離氨基酸含量測定:參照李琪等方法[20];脲酶含量測定:參照陳雷方法[21];胰蛋白酶抑制因子含量測定:參照李文立等方法[22];小肽含量=酸溶性蛋白含量-游離氨基酸含量。

1.3 統計分析

數據分析采用IBM SPSS Statistics 23.0;作圖軟件應用Origin 8.6;響應面優化設計及分析應用Design-Expert 8.0.6。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 發酵時間對乳酸菌總活菌量的影響 如圖1所示,在接種NCU301固態強化發酵豆粕中,隨著發酵時間的變化,乳酸菌總活菌數一直保持在9.54 lg(CFU/g)以上,在發酵48 h時達到最大值,為9.84 lg(CFU/g),發酵48 h和60 h的乳酸菌總活菌數無顯著性差異(p>0.05),但與其它時間段的活菌數存在顯著性差異(p<0.05)。由此選擇適宜的發酵時間48 h。

圖1 發酵時間對乳酸菌總活菌數的影響Fig.1 Effect of fermentation time on total number of lactobacillus viable cells注:圖中不同字母表示差異性顯著(p<0.05), 相同字母表示差異性不顯著(p>0.05)(圖2～圖4同)。

2.1.2 發酵溫度對乳酸菌總活菌量的影響 微生物的生長對溫度較為敏感,所以發酵過程中溫度是影響微生物生長和產物合成的重要因素[23]。由圖2可知,豆粕發酵過程中乳酸菌總活菌數隨著溫度的升高呈現先緩慢增加后降低的趨勢,這是因為溫度升高反應速率加快,微生物的生長代謝也隨之加快,但溫度過高會降低反應速率,微生物的生長代謝活性也隨之降低,不利于發酵的進行[24]。確定適宜的溫度為32 ℃。

圖2 發酵溫度對乳酸菌活菌數的影響Fig.2 Effect of fermentation temperture on total number of lactobacillus viable cells

2.1.3 料水比對乳酸菌總活菌量的影響 料水比是影響發酵過程的另一重要因素,水分含量過低,基質過于干燥,不利于微生物對營養物質的吸收和代謝產物的分泌且影響化學反應速率。而含水量過高則會造成基質結塊,空氣流通不暢,染菌機率增加等不良影響[25]。由圖3可知,隨著料水比的比例增大,豆粕發酵過程中乳酸菌總活菌數呈現先上升,后緩慢降低的趨勢,在料水比1∶0.8的條件下,乳酸菌總活菌量最高,因此適宜的料水比為1∶0.8。

圖3 料水比對乳酸菌活菌數的影響Fig.3 Effect of material to water ratio on total number of lactobacillus viable cells

2.1.4 接種量對乳酸菌總活菌量的影響 發酵過程中,接種量過小,會延長微生物生長的遲緩期;接種量過大,發酵基質中的營養物質、水分等不能滿足微生物正常生長所需[26]。由圖4可知,豆粕發酵過程中接種量對乳酸菌總活菌量無顯著性差異(p>0.05),在8%時活菌量最高,因此選擇8%作為最適接種量。

圖4 接種量對乳酸菌活菌數的影響Fig.4 Effect of inoculation on total number of lactobacillus viable cells

2.2 響應面優化結果

在單因素實驗基礎上,以發酵時間、發酵溫度、料水比為自變量,以發酵結束后豆粕中乳酸菌總活菌數(Y)為響應值,確定最佳工藝條件,實驗設計及結果見表2。

表2 BOX-Behnken實驗設計及結果Table 2 Design and results for BOX-Behnken

使用Design-Expert 8.06軟件對數據進行分析,建立乳酸菌總活菌數(Y)與發酵時間(A)、發酵溫度(B)、料水比(C)關系的二次多元回歸模型:

Y=11.48-0.19A-1.49B+0.025C-1.75AB+0.025AC-1.23BC-1.29A2-2.69B2-2.86C2

回歸方差分析見表3,回歸模型(p<0.0001)差異極為顯著,表明該模型有效;失擬項是用來描述合適模型附近數據的變動,此失擬項的結果為0.6704,差異不顯著(p>0.05),表明擬合的模型效果較好;決定系數R2=0.9859,說明此方程的擬合度良好,能夠對NCU301固態發酵豆粕的理論值進行預測。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model

根據回歸分析和回歸擬合方程繪制相應的響應面分析圖及對應的等高線圖,如圖5所示。結果表明,發酵時間和發酵溫度及發酵溫度和料水比的交互作用對乳酸菌總活菌數的影響顯著。通過軟件分析得到最佳發酵工藝條件為:發酵時間50.0 h、發酵溫度30.0 ℃、料水比1∶0.82,在接種量8%的條件下,預測乳酸菌活菌數達到11.7×109CFU/g。以此條件進行三次實驗驗證,所得的乳酸菌活菌數為11.5×109CFU/g,與預測值的吻合度達到98.29%。

圖5 兩兩因素相互作用對乳酸菌 活菌數的等高線和響應面圖Fig.5 Counter chart and response surface for total number of lactobacillus viable cells under two factors interact

2.3 發酵前后營養成分及抗營養因子的變化

從表4可知,豆粕經過自然發酵和接種強化發酵后的營養成分均發生了變化,其中粗蛋白分別提高了4.13%和4.78%(p<0.05),可能是因為在發酵期間,基質中的養分被微生物消耗而導致粗蛋白所占的相對比例發生變化,同時微生物將基質中的非蛋白氮吸收轉化為菌體蛋白[27];由于強化發酵后的豆粕中微生物的總活菌量高于自然發酵豆粕中的微生物總活菌量,所以,豆粕經強化發酵后粗蛋白的含量高于自然發酵。豆粕經過自然發酵和強化發酵后,酸溶性蛋白分別提高了42.67%和36.04%(p<0.05),小肽含量分別顯著性的提高57.49%和52.21%(p<0.05),可能是因為發酵期間,微生物分泌的一些酶類物質將大分子蛋白降解為小分子的多肽和氨基酸[28];自然發酵期間豆粕中含有大量能夠分泌蛋白酶的霉菌等微生物,而在強化發酵期間,這類微生物的生長受到乳酸菌抑制[29],因此,自然發酵后豆粕中的酸溶性蛋白和小肽含量要高于強化發酵后豆粕中的酸溶性蛋白和小肽含量。游離氨基酸經強化發酵提高19.10%,而經自然發酵下降12.36%,這可能是因為自然發酵中某些微生物利用氨基酸作為氮源[30],以及發酵過程中的美拉德反應和酯化反應消耗了氨基酸[31],而在強化發酵中乳酸菌及其代謝物能夠抑制這類微生物的生長繁殖[32]。

表4 豆粕發酵前后營養成分及抗營養因子的變化Table 4 Changes of nutrients and anti-nutritional factors of fermented soybean and unfermented soybean

豆粕中存在多種會造成畜禽生產性能下降和飼料利用率降低的抗營養因子,而微生物發酵法可有效的降低這些抗營養因子的含量[33]。由表4知,胰蛋白酶抑制因子經自然發酵和強化發酵后分別降低了61.62%和89.56%(p<0.05),脲酶含量也下降了79.31%和91.72%(p<0.05),表明豆粕中胰蛋白酶抑制因子的含量和脲酶含量呈正相關關系,這與尹慧君的研究結果一致[34]。

3 結論

本實驗以NCU301作為強化發酵菌株,優化了豆粕固態強化發酵的生產工藝,最終確定最適的發酵條件為:發酵時間50.0 h、發酵溫度30.3 ℃、料水比1∶0.82、接種量8%,發酵結束后,豆粕中乳酸菌總活菌量提高至1.15×1010CFU/g。豆粕經接種強化發酵后與未發酵相比,其中粗蛋白、酸溶性蛋白、小肽、游離氨基酸總量與分別提高4.78%、36.04%、52.21%、19.10%,胰蛋白酶抑制劑活性和脲酶活性分別下降89.56%、91.72%,而與自然發酵后豆粕中的粗蛋白、游離氨基酸總量相比分別提高0.6%、35.89%,酸溶性蛋白、小肽,胰蛋白酶抑制劑活性和脲酶活性分別下降4.64%、3.35%、72.79%、60%。該發酵產品可以提高動物對飼料的消化性,增加動物的生產性能,同時富含益生菌等有益成分可以改善動物的胃腸道菌群,提高動物的免疫力,與滅菌的發酵豆粕相比,可以降低生產成本,這為發展現代畜牧業提供了理論基礎。

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