牦牛血胰蛋白酶水解液中抗菌肽的篩選研究

郝 剛,唐善虎,李思寧

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川成都 610041)

尋求新型抗菌劑是解決目前日趨嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性的一種途徑。抗菌肽又稱抗微生物肽(antimicrobial peptides)或肽抗生素(peptide antibiotics),是生物體內(nèi)源性具有強(qiáng)抗菌作用的多肽,是生物先天免疫的重要組成部分[1-2]。自上世紀(jì)七十年代瑞典科學(xué)家Boman等[3]在天蠶血淋巴中首次發(fā)現(xiàn)抗菌肽以來,抗菌肽一直是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外研究者相繼在兩棲動(dòng)物、昆蟲、魚類、哺乳動(dòng)物等各種生物中發(fā)現(xiàn)了大量的抗菌肽[4-6]。

現(xiàn)已從動(dòng)物血紅蛋白中分離出了具有抗菌活性的肽類,并對(duì)其生理功能進(jìn)行了分析。張艷梅等從豬血中提取的抗菌肽不僅對(duì)供試細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)有明顯的損傷作用,同時(shí)還影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖[7]。張慶華等從牛血中分離的血紅蛋白抗菌肽對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的MIC分別為0.5、1.0、0.25 mg/mL[8]。抗菌肽P3是從牛血紅蛋白α亞基分離出來的一種廣譜抗菌肽,對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌均有一定的抑制活性[9]。

牦牛主要分布在我國(guó)青藏高原3000 m以上的高寒地帶,牦牛血液紅細(xì)胞中含有高達(dá)9%以上的血紅蛋白[10-11]。目前,對(duì)牦牛血的研究報(bào)道主要集中在提取超氧化物歧化酶、血紅素、免疫球蛋白等[12],關(guān)于牦牛血紅蛋白抗菌肽分離純化的研究未見報(bào)道。研究指出,利用抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞之間的吸附結(jié)合性質(zhì),將經(jīng)過細(xì)菌細(xì)胞吸附后的樣品與吸附前樣品組分進(jìn)行對(duì)比,能夠快速準(zhǔn)確的定位抗菌肽組分,提高分離效率[13]。本研究以牦牛血的胰蛋白酶水解液為原料,經(jīng)胰蛋白酶酶解,利用抗菌肽與大腸桿菌細(xì)胞的吸附結(jié)合特性,用Sephadex G-15凝膠色譜和C18反相高效液相色譜(RP-HPLC)分離純化新型抗菌肽,并檢測(cè)新抗菌肽的抑菌活性,為抗菌肽這類含量較少的生物活性物質(zhì)的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichcoli)ATCC 25922、綠膿桿菌(Bacteriumpyocyaneum)ATCC 27553、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)50013、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)51302、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)6538、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)9372、單胞李斯特菌(Listeriamonocytogene)54002、溶血鏈球菌(Streptococcushemolyticus)、變形鏈球菌(Streptococcusmutans)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)ATCC 49619、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、粘質(zhì)沙雷菌(Serratiamarcescens)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、新型串酵母(Cryptococcusneoformans)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 以上菌株由西南民族大學(xué)食品科學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存;牦牛血 成都天屹生物科技有限公司;檸檬酸鈉、乙酸、乙酸鈉、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 成都科龍化工試劑廠;苯甲基磺酰氟(PMSF) Amresco公司;胰蛋白酶(酶活10萬(wàn)U/g) 河南唐古食品配料有限公司;三氟乙酸(TFA) 色譜純,Fluka公司;乙腈 色譜純,Merck公司;Sephadex G-15 Sigma公司;LB培養(yǎng)基(溶菌肉湯培養(yǎng)基) 青島青藥生物工程有限公司;PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基) 南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司。

半制備型高效液相色譜儀(YWG C18250 mm×10 mm) 美國(guó)Waters公司;Centrifuge 5804型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;FE20型pH計(jì) 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH-6型恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;ELX808酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-TEK公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牦牛血酶解液的制備 收集新鮮的牦牛血,過100目篩網(wǎng),加入10%檸檬酸鈉迅速抗凝[14],2000×g離心10 min取紅血球,按1∶1加水(重量比),快速攪拌破膜,調(diào)節(jié)pH至8.0,按紅血球量加入0.03‰胰蛋白酶,50 ℃下酶解10 h。酶解結(jié)束后,調(diào)節(jié)pH至5.0以下,同時(shí)加熱至90 ℃以上維持30 min滅酶,然后2000×g離心10 min取上清液,即得到牦牛血酶解液。

1.2.2 抗菌肽細(xì)菌吸附結(jié)合實(shí)驗(yàn) 參考Tang的方法[13]。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌2000×g離心10 min,收集菌體,用無菌PBS(10 mmol/L,pH7.0)緩沖液洗滌,然后與牦牛血酶解液混合,于37 ℃孵育10 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,濾液即為細(xì)菌吸附結(jié)合后的牦牛血酶解液,將其冷凍干燥,-70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 凝膠過濾層析確定目標(biāo)抗菌肽 實(shí)驗(yàn)采用Sephadex G-15凝膠柱(50 cm×2 cm),用緩沖液進(jìn)行平衡。取3 mL牦牛血酶解液上樣,緩沖液洗脫20 h,在220 nm監(jiān)測(cè)洗脫情況;同樣取3 mL細(xì)菌結(jié)合后的牦牛血酶解液(1.2.2制備)上樣,洗脫條件同上。對(duì)比兩凝膠色譜圖,細(xì)菌結(jié)合后的牦牛血酶解液凝膠色譜圖減少的洗脫峰即為含有目標(biāo)抗菌肽的組分。在其他條件相同的情況下,探討了洗脫液類型(pH7.0磷酸鹽緩沖溶液、pH5.0醋酸緩沖溶液、Tris-鹽酸緩沖溶液)與洗脫流速(0.1、0.4、1.0 mL/min)對(duì)Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響。

1.2.4 反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化 參考Hocquellet 的方法[15],對(duì)確定含有目標(biāo)抗菌肽的凝膠色譜洗脫峰進(jìn)行收集,采用YWG C18反相柱(250 mm×10 mm×10 μm)進(jìn)行RP-HPLC分離純化。流動(dòng)相A:0.1% TFA溶液,B:80% 乙腈(含0.1% TFA);色譜條件:色譜柱用0.1% TFA平衡后,采用線性梯度法進(jìn)行洗脫并收集,梯度為B:0～100%洗脫80 min,上樣量2 μL,流速1 mL/min。在214 nm處測(cè)其光密度,收集各單峰進(jìn)行純化。抗菌活性組分凍干后,用0.1%TFA溶解后再次經(jīng)過Kromasil C18反相柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)進(jìn)行二次HPLC分離,流速0.5 mL/min,其它色譜條件同上。

1.2.5 抗菌肽抑菌活性的測(cè)定 最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)參考文獻(xiàn)[16]方法測(cè)定。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的待測(cè)菌液(細(xì)菌接種在LB培養(yǎng)基、真菌接種在PDA培養(yǎng)基,當(dāng)菌數(shù)達(dá)到104～105CFU/mL時(shí)得到待測(cè)菌液)加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔50 μL,再向各孔中加入50 μL經(jīng)倍比稀釋的抗菌肽,使各孔中抗菌肽濃度分別為0.5、1、2、4、8、16 μg/mL。以加入0.4%多聚甲醛50 μL的孔為陽(yáng)性對(duì)照,加入滅菌的去離子水50 μL的孔為陰性對(duì)照。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)6 h,真菌在28 ℃培養(yǎng)12 h后,用酶標(biāo)儀在λ=630 nm檢測(cè)OD值。與初始值相比,OD值未有顯著變化的最小抗菌肽濃度定義為抗菌肽對(duì)該菌的最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 Sephadex G-15凝膠過濾分離抗菌肽

2.1.1 洗脫液類型對(duì)Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響 其它層析條件不變的情況下,3種不同的緩沖溶液分離效果如圖1所示(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。對(duì)比三種洗脫緩沖液,在其它分離條件不變的情況下,10 mmol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液分離效果相對(duì)較好(見圖Ⅲ),牦牛血酶解液可大致分為7個(gè)組分。因此本實(shí)驗(yàn)采用磷酸鹽緩沖液為最佳洗脫液。

圖1 不同類型洗脫液對(duì)Sephadex G-15 分離抗菌肽效果的影響Fig.1 Effect of different elution buffers on the separation of antimicrobial peptide

2.1.2 洗脫劑流速對(duì)Sephadex G-15分離抗菌肽效果的影響 洗脫液的流速也是影響分離效果的重要因素。不同流速洗脫液分離抗菌肽效果見圖2(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。從圖2可以看出,當(dāng)流速為1 mL/min時(shí),由于流速過快,導(dǎo)致出峰的時(shí)間相對(duì)提前,峰形扁平,有一些小峰沒有分開。流速0.4 mL/min時(shí)分離效果好,分離時(shí)間較短。流速0.1 mL/min時(shí),低流速會(huì)引起分離時(shí)間的延長(zhǎng),工作效率降低,因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.4 mL/min為最佳流速。

圖2 不同洗脫流速對(duì)Sephadex G-15 分離抗菌肽效果的影響Fig.2 Effect of different flow rates on the separation of the antibacterial peptide

綜合以上分析結(jié)果,用Sephadex G-15分離牦牛血酶解液抗菌肽時(shí),樣品濃度50 mg/mL,上樣量3.0 mL,流速0.4 mL/min,磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.0)為洗脫劑,可取得較好的分離效果。在此條件下,分離得到了7個(gè)組分,見圖3。

圖3 Sephadex G-15分離抗菌肽凝膠色譜圖Fig.3 Gel filtration chromatography profile of the antibacterial peptides on Sephadex G-15 column

2.2 細(xì)菌胞膜吸附分離牦牛血酶解液抗菌肽

2.2.1 細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn) 牦牛血酶解液與大腸桿菌孵育后,其中膜作用抗菌肽會(huì)與細(xì)菌細(xì)胞結(jié)合,并隨菌體一同被過濾去除[13]。與細(xì)菌結(jié)合后的牦牛血酶解液的凝膠色譜圖見圖4。與圖3(未與細(xì)菌孵育的牦牛血酶解液凝膠過濾圖)相比,圖4中洗脫峰2和峰5減少,其余洗脫峰與圖3中相應(yīng)洗脫峰的峰形和洗脫時(shí)間相類似。由此推斷,峰2與峰5應(yīng)該為含有目標(biāo)抗菌肽的組分。分別對(duì)峰2和峰5組分進(jìn)行活性測(cè)定,發(fā)現(xiàn)峰5抗菌活性高于峰2。因此選擇峰5組分進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化。

圖4 與大腸桿菌結(jié)合后牦牛血酶解液的G-15凝膠色譜圖Fig.4 Elution profile of yak blood zymolyte incubated with E. coli on Sephadex G-15 column

2.2.2 緩沖液pH對(duì)于細(xì)菌吸附結(jié)合實(shí)驗(yàn)的影響 為了驗(yàn)證細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,將大腸桿菌在pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中與牦牛血酶解液孵育,孵育后的濾液用Sephadex G-15柱進(jìn)行分析,結(jié)果見圖5(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)。

圖5 不同pH下與大腸桿菌結(jié)合后的牦牛血酶解物的凝膠色譜圖Fig.5 Elution profile of yak blood zymolyte incubated with E. coli on Sephadex G-15 column under different pH

從圖5中可看出,濾液分離后都得到5個(gè)組分。與圖3對(duì)比發(fā)現(xiàn),圖5中的峰2和峰5均顯著下降或消失,因此認(rèn)為利用細(xì)胞膜結(jié)合分離抗菌肽組分的重復(fù)性較好。在用Sephadex G-15凝膠柱分離抗菌肽時(shí),發(fā)現(xiàn)洗脫液的類型對(duì)洗脫效果影響最大,醋酸緩沖液(pH5.0)和Tris-鹽酸緩沖液(pH8.5)都無法把組分分離完全,這可能是相對(duì)于磷酸鹽緩沖液(pH7.0),pH的改變使得酶解液中某些肽的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的電離發(fā)生變化,肽與肽之間的相互作用發(fā)生了改變,從而使得某些組分難以分開。中性磷酸鹽對(duì)于反相液相色譜分離效果是一種好的方法,且在此條件下蛋白可保持生物活性[17]。

2.3 RP-HPLC分離純化抗菌肽

采用半制備型RP-HPLC(YWG C18250 mm×10 mm)進(jìn)一步純化圖3中的峰5,結(jié)果見圖6。對(duì)圖6中的各個(gè)組分進(jìn)行收集,檢測(cè)其抗菌活性,活性最強(qiáng)的目標(biāo)峰組分進(jìn)一步采用RP-HPLC(Kromasil C18250 mm×4.6 mm)純化,結(jié)果如圖7所示。目標(biāo)抗菌組分大約在53%乙腈(體積比)流動(dòng)相洗脫下來的,這表明抗菌組分具有較強(qiáng)的表面疏水性。抗菌物質(zhì)與細(xì)菌細(xì)胞膜的疏水作用對(duì)于其殺菌作用非常重要。Conlon等[18]研究表明抗菌肽可通過抗菌肽疏水的表面與細(xì)胞膜脂部分以及抗菌肽親水基團(tuán)與細(xì)胞膜磷脂頭部親水部分結(jié)合。膜肽相互作用是由靜電相互作用和疏水相互作用決定的,而且這兩種相互作用存在敏感的平衡關(guān)系[19]。因此綜合實(shí)驗(yàn)分析,推測(cè)抗菌肽YakB-1/2在pH7.0時(shí)的帶電荷量較少,與細(xì)菌細(xì)胞膜的吸附結(jié)合主要依靠疏水相互作用。

圖6 峰5組分的RP-HPLC圖譜(YWG C18 250×10 mm)Fig.6 RP-HPLC profile of peak 5(YWG C18 250×10 mm)

圖7 抗菌組分目標(biāo)峰進(jìn)一步RP-HPLC純化圖譜(Kromasil C18 250 mm×4.6 mm)Fig.7 RP-HPLC profile of further purification of antimicrobial fraction(Kromasil C18 250 mm×4.6 mm)

對(duì)于RP-HPLC組分1和2再次進(jìn)行高效液相分析,結(jié)果顯示其為單一峰,已經(jīng)達(dá)到色譜純(圖8),出峰時(shí)間分別為51.23 min及59.50 min。將組分1和2的抗菌肽分別命名為YakB-1和YakB-2。

圖8 抗菌肽RP-HPLC 組分1和2的二次RP-HPLC圖譜Fig.8 Subfraction of fraction 1 and 2 from the RP-HPLC

2.4 抗菌肽YakB-1/2的抑菌活性檢測(cè)

抗菌肽Buforin的MIC作為對(duì)照,抗菌肽YakB-1/2的抑菌活性結(jié)果見表1。

表1 YakB-1,YakB-2及抗菌肽Buforin的抗菌活性Table 1 Antimicrobial activitiy of YakB-1,YakB-2 and Buforin

總體上來看,抗菌肽YakB-2無論對(duì)G-菌還是G+菌的抗菌活性要比YakB-1強(qiáng)。無論是YakB-1還是YakB-2,對(duì)G+菌的抑菌活性比G-菌強(qiáng),YakB-2尤其明顯。這可能是因?yàn)镚-菌和G+菌外膜的組成成分不同[20]。除了新型串酵母,YakB-1對(duì)真菌的抑菌活性比YakB-2強(qiáng),而抗菌肽YakB-1/2對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌活性都弱于Buforin。抗菌肽YakB-1/2的抑菌機(jī)理、氨基酸序列、與胞膜作用時(shí)的結(jié)構(gòu)變化及膜作用機(jī)制還需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步摸索和探究。

3 結(jié)論

牦牛血酶解液濃度50 mg/mL,上樣量3.0 mL,流速0.4 mL/min,10 mmol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液為洗脫劑,用Sephadex G-15分離牦牛血酶解液抗菌肽可取得較好的分離效果,獲得分離度較好的7個(gè)組分。通過RP-HPLC純化牦牛血酶解液中抗菌肽組分,分離得到兩個(gè)色譜純的抗菌肽YakB-1和YakB-2。菌肽YakB-1/2對(duì)細(xì)菌和真菌都具有廣譜抗菌活性,但抗菌肽YaKB-2對(duì)細(xì)菌的抗菌活性比YakB-1強(qiáng),YakB-1對(duì)真菌的抑菌活性更強(qiáng)。

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