超高壓輔助制備老蒜提取物工藝研究

劉 暢,劉 銳,3,吳 濤,3,張 民,3,*

(1.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457; 2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457； 3.天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心,天津 300457)

大蒜(Allium Sativum)為百合科蔥屬植物生蒜的地下鱗莖,原產(chǎn)于西亞和中亞一帶,世界各國均有分布[1-2]。我國大蒜資源豐富,據(jù)統(tǒng)計(jì),日本和東南亞市場(chǎng)上80%的大蒜來自我國[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,大蒜具有豐富的生物活性功能,如抗氧化、預(yù)防心血管疾病、增強(qiáng)免疫功能、抑菌、抗腫瘤、預(yù)防糖尿病、保護(hù)肝臟等[4-6]。老蒜提取物(AGE)作為一種大蒜精深加工產(chǎn)品,具有良好的抗氧化能力,對(duì)糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥等疾病的預(yù)防等具有積極作用[7-9];而且相對(duì)其它大蒜制品,AGE刺激性低,即使高劑量使用也是無害的,具有良好的食用安全性,可用于膳食補(bǔ)充劑,已得到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。

目前,AGE生產(chǎn)普遍采用Wakunaga制藥有限公司建立的工藝,具體是將新鮮大蒜蒜片在室溫下用15%～25%的乙醇水溶液浸泡10個(gè)月或者20個(gè)月以上,過濾后的浸提液經(jīng)減壓低溫濃縮后得到AGE[10],符合商業(yè)老蒜提取物中SAC含量為1.6～2.4 g/kg(干重)的標(biāo)準(zhǔn)[11]。但該方法存在生產(chǎn)周期較長的問題,同時(shí)乙醇濃度較高,生產(chǎn)成本也隨之增加。本課題組[12]前期研究制備了兩種老蒜提取物,一種是將新鮮大蒜去皮、切片后,以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于乙醇濃度為10%(v/v)的溶液中,室溫條件下避光浸泡90 d后濃縮所得,其SAC含量為1.6 g/kg(干重);另一種是將新鮮大蒜去皮、切片后以1∶6 g·mL-1的料液比浸泡于蒸餾水中,室溫條件下避光浸泡20 d濃縮所得,其SAC含量為1.8 g/kg(干重)。上述方法均為直接溶劑浸提法,顯著縮短了生產(chǎn)周期,同時(shí)降低了乙醇溶液濃度。

為了進(jìn)一步優(yōu)化老蒜提取物生產(chǎn)工藝,本文擬采用超高壓輔助浸提法,研究不同超高壓處理?xiàng)l件對(duì)老蒜提取物的抗氧化活性的影響,結(jié)合老蒜提取物制備過程中主要功能成分含量的變化,考察浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物制備的影響,確定一種超高壓輔助制備老蒜提取物的工藝方法,旨在縮短生產(chǎn)周期,降低乙醇溶液濃度或提高SAC活性成分含量,從而為老蒜產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普通白皮大蒜 山東萊蕪;濃硫酸、濃鹽酸 天津國藥集團(tuán)有限公司;無水乙醇 天津市江天化工技術(shù)有限公司;甲醇 天津市康科德科技有限公司 色譜純;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、2,4,6-三吡啶基三嗪 美國Sigma公司;蒜氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、S-烯丙基半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Fluka公司,≥90%;無特殊說明均為分析純?cè)噭?/p>

HPP.L2-600/0.6超高壓設(shè)備 天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;TU-1810 PC型紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;LC-20AT高效液相色譜儀泵、CTO-10AS柱溫箱、SPD-20A紫外檢測(cè)器 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 超高壓輔助制備大蒜提取物 將新鮮大蒜去皮、切片,按一定料液比立即浸泡于一定濃度的乙醇溶液中,在室溫條件下進(jìn)行超高壓處理,超高壓處理后的液體溶液經(jīng)定性濾紙常壓過濾后即為目標(biāo)大蒜提取物,通過測(cè)定大蒜提取物的DPPH·清除率、·OH清除率、總抗氧化能力等確定提取條件[13-14],分別考察超高壓處理壓力(100、200、300、400、500、600 MPa)、保壓時(shí)間(1、3、5、7、9、11 min)、乙醇濃度(0%、10%、20%、30%、40%,均為v/v)、料液比(1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15 g·mL-1)對(duì)浸提液抗氧化活性的影響,固定的因素及水平為：處理溫度為室溫，超高壓處理壓力為300 MPa，保壓時(shí)間為30 min,乙醇濃度為10%，料液比為1∶6 g·mL-1。

1.2.2 老蒜提取物的制備 結(jié)合大蒜提取物超高壓?jiǎn)我蛩貙?shí)驗(yàn)結(jié)果,考察浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物制備過程中抗氧化活性的影響,配制相同濃度(0.024 mg/mL)抗壞血酸溶液作為對(duì)照,以浸提液抗氧化測(cè)定數(shù)據(jù)占抗壞血酸溶液測(cè)定數(shù)據(jù)比例為結(jié)果。以處理壓力200、300、400 MPa,保壓時(shí)間5 min,料液比1∶9 g·mL-1,乙醇濃度10%(v/v)作為處理?xiàng)l件,并以未經(jīng)超高壓處理直接浸泡作為對(duì)照,每隔5 d取樣,分別測(cè)定DPPH·清除率、·OH清除率、總抗氧化能力等抗氧化活性,S-烯丙基半胱氨酸、S-烯丙基半胱氨酸亞砜、總糖等功能成分含量,從而確定浸泡時(shí)間。

1.2.3 DPPH·清除率實(shí)驗(yàn) 配制0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液:準(zhǔn)確稱取7.89 mg DPPH溶于少量無水乙醇中,定容至100 mL,即得。各組加樣分別為:吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為Ac;吸取3.0 mL DPPH乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為As;吸取3.0 mL無水乙醇溶液,加入3.0 mL樣品溶劑,記為Ab。室溫避光反應(yīng)20 min,于517 nm處測(cè)定各組吸光度值,每組樣品測(cè)定3個(gè)平行[15]。根據(jù)下列公式計(jì)算得到清除率。

DPPH·清除率(%)=(1-(As-Ab)/Ac)×100

1.2.4 ·OH清除率實(shí)驗(yàn) 采用Fenton反應(yīng)體系,·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2體系產(chǎn)生。由于·OH可特異性地使番紅花紅T褪色,可根據(jù)番紅花紅T褪色程度用比色法測(cè)定·OH清除率。分別配制pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液,1 mmol/L番紅花紅T溶液,4 mmol/L硫酸亞鐵溶液、4 mmol/L EDTA-2Na溶液,3% H2O2溶液。將4 mmol/L EDTA-2Na溶液和4 mmol/L硫酸亞鐵溶液等體積混合得到2 mmol/L EDTA-Fe儲(chǔ)備液。各組分別按照順序加樣:2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3%H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL樣品溶劑,記為A0;2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL蒸餾水,2.0 mL樣品溶劑,記為Ai;2.0 mL磷酸鹽緩沖溶液,0.2 mL番紅花紅T,2.0 mL 3% H2O2,2.0 mL EDTA-Na2-Fe(Ⅱ),2.0 mL樣品溶液,記為A。將各組混合均勻后,在37 ℃條件下水浴30 min,于520 nm處測(cè)定吸光度值,每組樣品測(cè)定3個(gè)平行。根據(jù)下列公式計(jì)算得到清除率。

·OH清除率(%)=((A-A0)/(Ai-A0))×100

1.2.5 總抗氧化能力測(cè)定 采用FRAP法測(cè)定總抗氧化能力[15]。分別配制0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液,40 mmol/L鹽酸溶液,20 mmol/L氯化鐵溶液,10 mmol/L TPTZ溶液;再以10∶1∶1的體積比取0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液,20 mmol/L氯化鐵溶液,10 mmol/L TPTZ溶液均勻混合,得到FRAP工作液,使用前放置于37 ℃水浴中保溫。吸取0.2 mL樣品溶液,再加入5.0 mL預(yù)熱好的FRAP工作液,混勻后室溫放置10 min,于593 nm處測(cè)定吸光度值,每組樣品3個(gè)平行。同時(shí),配制一系列濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液代替樣品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以FeSO4濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。對(duì)應(yīng)回歸方程計(jì)算出浸提液的FRAP值,從而得到樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱。

1.2.6 總糖含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖含量[17]。配制6%重蒸苯酚。準(zhǔn)確稱取干燥至恒重的果糖10 mg,加蒸餾水定容至100 mL,得到100 μg/mL果糖對(duì)照品溶液,分別吸取果糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL,各加入蒸餾水均補(bǔ)至2.0 mL,然后加入1.0 mL 6%重蒸苯酚,混合均勻后加入濃硫酸5.0 mL,搖勻后室溫放置20 min,于490 nm處測(cè)定吸光度值。同時(shí)以2.0 mL蒸餾水替代標(biāo)準(zhǔn)溶液按同樣顯色方法操作為空白作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以果糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。同樣方法測(cè)定樣品溶液中總糖含量。

1.2.7 S-烯丙基半胱氨酸(SAC)含量測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定SAC含量[12]。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的SAC標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜甲醇中,以流動(dòng)相稀釋至一系列濃度為25、50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后進(jìn)行測(cè)定。液相色譜條件為流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=10∶90,流速為0.8 mL/min,色譜柱為Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高壓洗脫,紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長220 nm,進(jìn)樣量20 μL。按照上述色譜條件測(cè)定后,以峰面積積分值A(chǔ)為橫坐標(biāo),SAC濃度C為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。同樣方法測(cè)定樣品溶液中SAC含量。

1.2.8 S-烯丙基半胱氨酸亞砜(SACS)含量測(cè)定 采用高效液相色譜法測(cè)定SACS含量[3]。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的SACS標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜甲醇中,以流動(dòng)相稀釋至一系列濃度為90、150、225、300、450、600、750 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,經(jīng)0.22 μm有機(jī)系濾膜過濾后進(jìn)行測(cè)定。液相色譜條件為流動(dòng)相V(甲醇)∶V(水)=20∶80,流速為0.8 mL/min,色譜柱為Kromasil 100-5 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),二元高壓洗脫,紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長214 nm,進(jìn)樣量20 μL。按照上述色譜條件測(cè)定后,以峰面積積分值A(chǔ)為橫坐標(biāo),SACS濃度C為縱坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。同樣方法測(cè)定樣品溶液中SACS含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,使用origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理作圖,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組間比較采用One-way ANOVA進(jìn)行顯著性分析,p<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓輔助制備老蒜提取物處理?xiàng)l件的確定

2.1.1 超高壓處理壓力對(duì)浸提液抗氧化活性的影響 由表1可知,隨著超高壓處理壓力的增加,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及總抗氧化能力均呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)處理壓力為300 MPa時(shí),DPPH·清除率最高,可達(dá)到89.50%;·OH清除率在較低處理壓力具有較高的清除率,當(dāng)處理壓力為100 MPa時(shí),·OH清除率最高為80.67%;而浸提液總抗氧化能力與DPPH·清除率結(jié)果一致,當(dāng)處理壓力為300 MPa時(shí)最高,FRAP值達(dá)到0.534 mmol/L。結(jié)果表明,經(jīng)過超高壓處理后,浸提液抗氧化活性均較未處理樣品明顯提高,不同處理壓力對(duì)浸提液DPPH·清除率、·OH清除率及總抗氧化能力等抗氧化活性影響程度不同。

表1 處理壓力對(duì)浸提液抗氧化活性的影響Table 1 Effect of treatment pressure on the antioxidant activities of extracts

綜合分析超高壓處理壓力對(duì)浸提液抗氧化活性結(jié)果可知,浸提液DPPH·清除率與總抗氧化能力的變化趨勢(shì)一致,均在300 MPa下為最優(yōu),而·OH清除率隨處理壓力變化規(guī)律不明顯,無法確定最優(yōu)的超高壓處理壓力。因此,選取DPPH·清除率和總抗氧化能力均較高的處理壓力200、300和400 MPa,在隨后考察浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物產(chǎn)品影響時(shí),進(jìn)一步以老蒜提取物中SAC含量為指標(biāo),確定超高壓處理壓力最優(yōu)條件。

2.1.2 超高壓保壓時(shí)間對(duì)浸提液抗氧化活性的影響 由表2可知,隨著保壓時(shí)間的延長,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均呈波動(dòng)變化,當(dāng)保壓時(shí)間為5 min時(shí),DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均處于較高水平,分別為87.13%、80.44%和0.239 mmol/L。因此,最佳保壓時(shí)間5 min作為處理?xiàng)l件。與不同超高壓處理壓力結(jié)果一致,經(jīng)過超高壓處理后,浸提液抗氧化活性均較未處理樣品明顯提高。

表2 保壓時(shí)間對(duì)浸提液抗氧化活性的影響Table 2 Effect of holding time on the antioxidant activities of extracts

2.1.3 乙醇濃度對(duì)浸提液抗氧化活性的影響 由表3可知,隨著乙醇濃度的增大,浸提液DPPH·清除率和總抗氧化能力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)乙醇濃度10% 時(shí),DPPH·清除率和FRAP值分別可達(dá)到85.59%和0.227 mmol/L;浸提液·OH清除率隨乙醇濃度的增大呈下降的趨勢(shì),蒸餾水作為浸提溶劑時(shí),·OH清除率為37.74%。結(jié)果表明,較高的乙醇濃度會(huì)使浸提液抗氧化活性降低。然而,根據(jù)課題組前期研究結(jié)果,當(dāng)采用蒸餾水作為溶劑進(jìn)行老蒜提取物制備時(shí),雖然SAC含量有所上升,但SACS含量較乙醇溶液作為浸提液時(shí)有所降低[12]。綜合上述結(jié)果,選擇10%乙醇溶液作為浸提溶劑。此時(shí),浸提液各項(xiàng)抗氧化活性指標(biāo)均處于較高水平。

表3 乙醇濃度對(duì)浸提液抗氧化活性的影響Table 3 Effect of ethanol concentration on the antioxidant activities of extracts

2.1.4 料液比對(duì)浸提液抗氧化活性的影響 由表4可知,隨著料液比的逐漸增大,浸提液DPPH·清除率、·OH清除率和總抗氧化能力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1∶9 g·mL-1時(shí),DPPH·清除率、·OH清除率和FRAP值均最高,分別達(dá)到68.70%,28.01%和0.119 mmol/L。結(jié)果表明,料液比對(duì)老蒜提取物抗氧化活性影響較大,隨著料液比的增大,有利于超高壓處理對(duì)活性成分的提取,這可能是由于在高壓狀態(tài)下料液比過低,體系中溶劑的流動(dòng)性受到一定的束縛,從而抑制了活性成分的擴(kuò)散與運(yùn)動(dòng);當(dāng)料液比過高時(shí),即反應(yīng)體系中底物濃度過低,會(huì)抑制γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、蒜氨酸酶等參與的酶促反應(yīng)的反應(yīng)速率,同時(shí)料液比增大使得溶劑使用和后期溶劑濃縮成本提高[18]。因此,選擇料液比1∶9 g·mL-1作為處理?xiàng)l件。該條件下,浸提液各項(xiàng)抗氧化活性均處于較高水平。

表4 料液比對(duì)浸提液抗氧化活性的影響Table 4 Effect of solid to liquid radio on the antioxidant activities of extracts

2.2 浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物性質(zhì)的影響及浸泡時(shí)間的確定

2.2.1 浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物抗氧化活性的影響 由圖1可知,隨著浸泡時(shí)間的延長,各組浸提液DPPH·清除率在前20 d顯著下降,隨后趨于平緩,并且經(jīng)200 MPa處理的浸提液DPPH·清除率高于其它處理壓力下的各組浸提液;由圖2、圖3知，各組浸提液·OH清除率和總抗氧化能力隨浸泡時(shí)間的延長波動(dòng)較大。結(jié)果表明,在蒜老化的過程中,通過酶促和化學(xué)反應(yīng)自然產(chǎn)生了很多中間化合物,而這些化合物隨著浸泡時(shí)間的延長不斷進(jìn)行轉(zhuǎn)化最終形成老蒜提取物活性成分SAC和其它揮發(fā)性丙基硫化物,這些化合物對(duì)浸泡過程中抗氧化活性起到重要的影響,但目前機(jī)理尚未完全明確[19]。

圖1 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的DPPH·清除率Fig.1 DPPH· scavenging rate of AGE with different treatment conditions

圖2 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的·OH清除率Fig.2 ·OH scavenging rate of AGE with different treatment conditions

圖3 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的總抗氧化能力Fig.3 FRAP value of AGE with different treatment conditions

2.2.2 浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物功能成分含量的影響 考察浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物制備過程中功能成分含量的影響,測(cè)定結(jié)果如圖4～圖6。由圖4可知,隨著浸泡時(shí)間的延長,各組浸提液總糖含量呈先上升后下降的趨勢(shì),且經(jīng)200 MPa處理后的樣品在較多時(shí)間點(diǎn)高于其他組樣品,且在55 d時(shí)達(dá)到較高值。由圖5可知,隨著浸泡時(shí)間的延長,200、300 MPa與未處理組浸提液SAC含量呈先上升后趨于平緩的趨勢(shì),而400 MPa條件下基本無明顯上升趨勢(shì)且含量較低,其中200 MPa條件下SAC含量上升最為明顯,且在較多時(shí)間點(diǎn)高于其他組樣品,并在55 d時(shí)達(dá)到較高值,這與文獻(xiàn)報(bào)道中隨著浸泡時(shí)間的延長,AGE中S-烯丙基半胱氨酸等水溶性有機(jī)化合物含量增加的結(jié)果一致[20]。由圖6可知,隨著浸泡時(shí)間的延長,各組浸提液SACS含量呈逐漸上升的趨勢(shì),且經(jīng)400 MPa處理后的樣品在較多時(shí)間點(diǎn)高于其他組樣品,這可能是由于較高的壓力使γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的酶活性降低,γ-谷氨酰半胱氨酸更多地通過氧化水解轉(zhuǎn)化為SACS,而不利于轉(zhuǎn)化為SAC[21]。綜合考慮浸泡時(shí)間對(duì)老蒜提取物制備過程的影響,且由于商業(yè)老蒜提取物以SAC含量為指標(biāo),因此,確定200 MPa,浸泡時(shí)間55 d為處理?xiàng)l件。在該處理?xiàng)l件下,AGE產(chǎn)品中SAC含量為123.2 mg/L,換算為干重為1.9 g/kg,符合商業(yè)老蒜提取物中SAC含量為1.6～2.4 g/kg(干重)的標(biāo)準(zhǔn)[11]。

圖4 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的總糖含量Fig.4 Fructose content in AGE with different treatment conditions

圖5 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸含量Fig.5 SAC content in AGE with different treatment conditions

圖6 不同處理?xiàng)l件下老蒜提取物的 S-烯丙基半胱氨酸亞砜含量Fig.6 SACS content in AGE with different treatment conditions

3 結(jié)論

通過研究超高壓處理?xiàng)l件對(duì)浸提液抗氧化活性及測(cè)定老蒜提取物制備過程中浸泡時(shí)間對(duì)浸提液性質(zhì)的影響,確定超高壓輔助制備老蒜提取物的最佳條件為：將新鮮大蒜去皮切片后,以料液比為1∶9 g·mL-1浸泡于10%的乙醇溶液中,于室溫條件下進(jìn)行超高壓處理,處理?xiàng)l件為壓力200 MPa,保壓時(shí)間5 min,再于室溫條件下避光保存55 d后制得老蒜提取物。該方法制得的AGE中SAC含量為1.9 g/kg(干重),符合商業(yè)老蒜提取物中SAC含量標(biāo)準(zhǔn)。因此,采用超高壓輔助制備老蒜提取物,不僅極大地縮短了溶劑浸泡制得老蒜提取物備的工藝周期,而且為老蒜產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

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