發(fā)酵大豆豆粕水提物分離純化ACE抑制活性小肽

崔云云,王正全,2,*,沈菊泉,陳建康,王 芳,楊 晗,劉 源,汪立平,*,謝 晶,4

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室(上海),上海 201306; 3.上海市食品研究所,上海 200237; 4.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心,上海 201306)

大豆原產中國,古稱菽,是全球特別是亞洲各國的主要糧食作物,因其富含植物蛋白和脂肪而被用于榨油和制作各種豆類制品,屬于廉價易獲得的優(yōu)質蛋白質來源。其風味發(fā)酵制品豆豉源于漢朝,口味獨特,近年更發(fā)現其含有諸多生物活性降解蛋白和肽,具有降低血壓活性如ACE抑制[1-4]。另外,大豆蛋白主要包含大豆球蛋白glycinin和大豆伴球蛋白β-conglycinin,經水解、酶解、發(fā)酵后過濾、分離的小肽物質同樣具有一定的血管活性或其他生物活性,如結合鈣離子、調節(jié)免疫系統、腦功能、神經系統、平衡營養(yǎng),甚至可以阻止肝、肺癌細胞克隆[5-7]。因此,大豆除食用外還用于調節(jié)人體內分泌和動物消化系統,甚至應用于兒童配方奶粉中[5-7]。其作用機理可能是鈣離子聚集、心血管平滑肌胞內鈣離子流出抑制、營養(yǎng)平衡、通過激活細胞通路來調節(jié)膽固醇代謝等[8-10]。

工業(yè)化生產大豆壓榨油產生大量的廢渣副產品豆粕,通常用作動物飼料,存在加工不完全、利用不徹底等浪費的問題。大豆粕本身就可以通過發(fā)酵和提取的方式直接再次利用其蛋白質,相關的分離提取ACE抑制活性小肽研究最多[11-13]。現在已知大豆粉和大豆豆粕發(fā)酵或水解產物中含有的降壓活性小肽物質如LVNGS、HGK、VLIVP、EVG、MLP、IAVPGEVA、IAVPTGVA、LPYP、LVQGS、VLIVP、RPSYT等[2,7-9,14-15]。其制備多使用各種商業(yè)消化蛋白酶、枯草芽孢桿菌、豆豉曲等水解[1-3,9,11,12,16-20],而分離提取則常采用沉淀、過濾、超濾、納濾、凝膠色譜、HPLC、大孔樹脂吸附、脫鹽等方式[16-18,21-23],尚有很多未知的活性物質未被發(fā)現。

因此,本研究在1965年Ferreira[24]和1971年Cushman[25]成功建立第一套ACE體外抑制的實驗系統的基礎上,結合Hyun[26]優(yōu)化的HPLC檢測改良方法,從大豆發(fā)酵水解超濾分離獲得的組分開始逐步篩選ACE抑制活性最強的組分,并從該組分中逐步通過GFC初步分離,HPLC兩輪分離純化收集。利用PPSQ-21和MALDI-TOF-TOF/MS雙重定性驗證肽序列,再經多肽固相合成法(solid phase peptide synthesis,SPPS)合成足量小肽,分別驗證其ACE抑制活性并比較。最后,篩選出的小肽的心血管體外實驗活性也被測定。本研究尋找新的血管活性大豆小肽,并嘗試闡釋其可能的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

二浸豆粕(粗蛋白質含量43%) 中糧集團;分析純硼酸、硼砂、乙腈 上海安普科技公司;馬尿酰組胺酰亮氨酸(HHL)、血管緊張素轉化酶(ACE) Sigma公司;三氟乙酸(TFA) Merck公司;馬尿酸、非極性DA201-C大孔樹脂 江陰有機化工廠;NaCl和弗羅里硅土(60～100目) 國藥集團提供;色譜純甲醇、乙腈 Thermo-fisher公司;400目濾布、10000、1000、500Da濾膜 上海摩速科學器材有限公司;實驗用水 Milli-Q提供;雄性8～11周齡的Sprague-Dawley(SD)大鼠 上海杰思捷實驗動物有限公司;乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)和苯腎上腺素鹽酸(Phenylephrine,PE) 百靈威科技有限公司;本研究中使用的菌種 為實驗室篩選于民間豆豉的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

HPLC(LC-20AT,搭載FRC-10A自動餾分收集系統)和蛋白測序儀PPSQ-21 日本Shimadzu公司;5800 MALDI-TOF-TOF/MS配有TOF/TOF Explorer和Data Explorer數據處理系統 美國AB SCIEX公司;實驗用膜分離超濾納濾反滲透裝置(RE-2540型) 上海摩速科學器材有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;KQ-250E超聲波清洗器、電熱恒溫水浴鍋HHS型、SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 上海圣科有限公司;分析天平 Sartorius公司;ALC-M system Tissue-Organ bath體外組織浴系統 上海奧爾科特生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 稱取二浸豆粕4 kg于30 L的發(fā)酵罐中,加蒸餾水浸濕并攪拌均勻,高壓蒸汽滅菌(121 ℃,30 min);接種10%菌懸液(取枯草芽孢桿菌管,在無菌操作條件下,用接種環(huán)挑取接種到適量的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,30 ℃下振蕩培養(yǎng)12 h),30 ℃,發(fā)酵72 h。發(fā)酵結束后振蕩水浸提取1 h,后靜止沉降,紗布過濾2遍除渣,得到發(fā)酵豆粕原液。

1.2.2 發(fā)酵豆粕原液ACE抑制肽的分離純化

1.2.2.1 發(fā)酵液的超濾 發(fā)酵液依次加入活性炭、DA201-C大孔樹脂吸附油脂、雜質顆粒并脫鹽,后用400目濾袋過濾除去吸附劑,再加入弗羅里硅土結合板式過濾機過濾除掉活性炭和多余油脂,得到更澄清的發(fā)酵液。用截留分子量為10000、1000、500 Da 的超濾膜分級過濾發(fā)酵液,得到3個不同分子量的多肽混合液組分F1(1000～10000 Da)、F2(500～1000 Da)、F3(<500 Da),濃縮后在-20 ℃,高真空10 Pa下冷凍干燥48 h,干燥物用以驗證各組分ACE抑制活性。

1.2.2.2 凝膠滲透色譜(GFC)法分離 將F3組分用Milli-Q水溶解制成濃溶液,用GFC進行分離并收集各洗脫峰組分。色譜條件:TSK-GEL G2000SWXL(φ7.8 mm×300 mm);流動相A,Milli-Q純水(0.1%TFA);流動相B,乙腈(0.1% TFA)。梯度洗脫條件:0～10 min 5% B,10～15 min 5% B,15～20 min 10% B;流速,1 mL/min;柱溫,30 ℃;波長,220 nm。

1.2.2.3 一次HPLC法分離 將經凝膠過濾色譜分離的組分用HPLC進行分離純化,分別收集各洗脫峰組分,進行冷凍干燥備用。色譜條件:Cosmosil 5 C18-AR-Ⅱ(φ4.6 mm×250 mm,100A);梯度洗脫條件,0～5 min 2.5% B,5～18 min 80% B;流動相A、流動相B、流速、柱溫、波長同1.2.2.2。

1.2.2.4 二次HPLC法再分離純化 更換色譜柱為Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ(φ4.6 mm×250 mm,100A),色譜條件和梯度洗脫條件同1.2.2.3。

1.2.2.5 大豆小肽的分子量測定及氨基酸序列分析 分別取2 μL的1000 mg/L最終分離純品,直接采用MALDI-TOF-TOF/MS進行質譜分析。激光源為335 nm波長的Nd:YAG激光器,加速電壓為20 kV,采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據。儀器先用myoglobin酶解肽段進行外標校正。基質和樣品的質量掃描范圍為100～1000 Da。得到的MS/MS譜圖采用儀器軟件DeNovo Explorer結合數據庫比對進行測序。同時,目標小肽需經過PPSQ-21定性驗證。

1.2.3 小肽固相合成 所有小肽使用標準固相肽合成法(SPPS),由Fmoc-citrulline-OH等試劑合成[9]。

1.2.4 ACE活性的測定 許多豆制品的ACE抑制活性測定使用紫外分光光度計快速檢測,但由于前處理過程中的未揮發(fā)乙酸乙酯會干擾檢測結果,而基于HPLC的檢測方法準確而穩(wěn)定[27-30]。因此,本研究使用改良方法測定小肽ACE抑制活性,在小試管中依次加入40 μL發(fā)酵酶解樣品、40 μL ACE(25 mU/mL)溶液,放入37 ℃恒溫水浴中保溫5 min后加入50 μL的HHL溶液開始反應,37 ℃下反應60 min后加入200 μL 1.0 mol/L HCl中止反應,同時用40 μL pH=8.3的硼酸緩沖溶液替代發(fā)酵酶解液來制備反應液,作為空白對照組。反應液經過0.45 μmol/L濾膜過濾后上HPLC檢測,通過定量馬尿酸的生成量計算小肽的ACE抑制活性。

ACE活性抑制率計算公式為:

ACE活性抑制率(%)=(A1-A2/A1)×100

式(1)

式中,A1-未添加樣品時的峰面積;A2-添加樣品后的峰面積。

1.2.5 小鼠血管活性的測定 實驗中使用SD大鼠,從腹主動脈放血致死后迅速取出胸主動脈,清除粘連的脂肪和結締組織,剪切主動脈2～3 mm血管環(huán),裝于組織浴中的兩根不銹鋼絲之間。使血管環(huán)在37 ℃ PSS緩沖液中通入95% O2/5% CO2,平衡45 min。然后將環(huán)逐漸拉伸至1 g預加的張力,平衡30 min至穩(wěn)定。通過配有MPA2000數據采集系統的張力傳感器測量血管收縮反應(單位,g)。為驗證主動脈環(huán)的生存活性,在肽誘導的血管舒張實驗之前,需加入1.0 μmol/L PE和1 mmol/L ACh來檢驗血管收縮反應,以此作為活環(huán)的標準。每組實驗以4 min時間間隔加入,以此記錄小肽對血管的舒張作用。能夠引起50%血管舒張效果(相較于血管最大收縮張力,g)的小肽的有效濃度,即小肽的血管舒張活性值EC50。

1.3 數據處理

用Microsoft Excel 2010和Origin 8.0軟件進行處理數據及作圖,統計學分析用SPSS 20.0軟件進行未配對Student’st-test分析,實驗結果以平均值±標準偏差表示,顯著性差異水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 超濾分離豆粕發(fā)酵組分及其ACE抑制活性

豆粕發(fā)酵酶解產物經超濾分離后得到3個肽組分(F1、F2、F3),它們的ACE抑制活性如圖1所示。

圖1 不同分子量豆粕發(fā)酵液超濾組分的ACE抑制率(n=3)Fig.1 The ACE-inhibitory activity of different molecular weight ultrafiltrates of fermented soybean meal(n=3)注:小寫字母不同代表差異顯著(p<0.05)。

由圖1可知,空白對照組未加發(fā)酵液,ACE抑制活性幾乎為0,而F1、F2、F3組分均具有ACE抑制活性,與空白對照差異顯著(p<0.05),且活性隨著分子量的減小而增大,F2、F3組分無顯著性差異(p>0.05)。其中,F3組分的ACE抑制活性相對最高,在濃度1 mg/mL時ACE抑制率為40.40%。這主要是因為F3組分含有更多2～6個氨基酸殘基的小肽。因此,后續(xù)研究選擇F3組分進行下一步分離純化。類似的血管活性同樣被記載于其他學者的研究中,如Chiang等[10]發(fā)現使用膜反應器獲得的分離大豆蛋白水解物的1 kDa的組分ACE活性明顯強于10 kDa和30 kDa組分及水解物原液,范遠景等[25]也發(fā)現不論是使用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶還是胰蛋白酶水解的大豆蛋白,小于1 kDa的組分的ACE抑制活性均遠強于3 kDa和10 kDa及更大分子量組分。

2.2 GFC分離F3組分

本實驗中用GFC分離豆粕發(fā)酵酶解產物F3組分,相比其他針對大豆蛋白水解物提取液等混合物的研究[1,10,25,33],找到關鍵起作用的活性物質并精準定性更加重要[2,13-14,18]。如圖2(A)所示,大豆蛋白水解物提取液F3組分由單一混合物分離出三個主要組分P1、P2和P3,后續(xù)分離純化以這三個GFC分離組分為主要研究對象。

圖2 大豆活性小肽分離純化的GFC和HPLC色譜圖Fig.2 GFC and HPLC chromatography of bioactive soybean small peptides during separation and purification

2.3 一次和二次HPLC分離P2、P3

用HPLC配合Cosmosil 5C18-AR-Ⅱ(φ4.6 mm×250 mm)色譜柱用于進一步分離P2見圖2(B),P3見圖2(C),由圖知組分P2、P3又被分離出了多個物質,存在干擾物,收集主峰后再經二次HPLC繼續(xù)分離純化。更換色譜柱Cosmosil 5C18-MS-Ⅱ(φ4.6 mm×250 mm,100A)繼續(xù)分離出P2-1見圖2(D)和P3-1見圖2(E),分別記為P2-1-2、P3-1-3。

2.4 MALDI-TOF-TOF/MS對組分P2-1-2、P3-1-3結構的解析

MAIDI-TOF-TOF/MS是目前蛋白質鑒定中精確測定分子質量的手段之一,特別適合對混合蛋白和多肽類物質的相對分子質量的測定,其靈敏度和分辨率較高。由圖3顯示,對組分P2-1-2、P3-1-3進行鑒定,肽序列分別為HAGR(His-Ala-Gly-Arg)和CGAAP(Cys-Gly-Ala-Ala-Pro)。相似技術也被應用于嬰兒配方奶[7]和乳酸菌發(fā)酵的酸奶[32]中定性檢測活性小肽成分。另外,PPSQ-21的序列分析結果確認了P2-1-2、P3-1-3確實是HAGR和CGAAP。

圖3 MALDI-TOF-TOF/MS定性測定組分 P2-1-2、P3-1-3的肽序列譜圖Fig.3 Peptide sequence profiles of components P2-1-2, P3-1-3 by MALDI-TOF-TOF/MS qualitative determination

2.5 小肽HAGR和CGAAP的ACE抑制活性鑒定

對于鑒定出肽序列的兩個小肽HAGR和CGAAP,后續(xù)使用SPPS合成,相同濃度的合成肽(2 mg/mL)的ACE抑制活性被檢測檢定,如表1所示。由表1可知,HAGR的ACE抑制活性接近F3組分,但明顯低于小肽CGAAP,而后者的ACE抑制率達到了77.79%,明顯高于3個組分F1、F2、F3的ACE抑制活性。任錦等[7]也是研究合成肽的ACE抑制活性,主要是由于天然提取的活性小肽純品量極少,僅足以定性判斷結構,活性研究需要大量的小肽純品,需要使用人工合成的方法獲得高純度的目標物。

表1 大豆豆粕分離小肽的ACE抑制活性和血管活性匯總表(n=3)Table1 ACE inhibition activity and vasorelaxation activity of soybean meal isolated small peptides(n=3)

2.6 小肽HAGR和CGAAP的血管活性鑒定

如表1所示,發(fā)酵大豆豆粕膜過濾分離的3個組分F1、F2、F3的大鼠血管活性的檢測結果顯示,F1和F3可以引發(fā)不同程度的對1 μmol/L PE收縮過的大鼠主動脈心血管環(huán)的舒張作用,分子量范圍是500 Da的F3組分的舒張血管活性最高,達到2.37 mmol/L。但是1000 Da的F2組分恰好展示了相反的趨勢,不僅沒有舒張血管,反而引起了血管收縮,收縮比例最高時達到39.94%。F3組分分離出的2個小肽的大鼠血管活性實驗顯示,HAGR和CGAAP對1 μmol/L PE收縮過的大鼠主動脈心血管環(huán)具有舒張作用,如圖4所示,舒張效果強烈。另由表1可知,2個小肽的血管舒張活性都高于混合物組分F1和F3,但HAGR的血管活性(EC50=0.96 mmol/L)稍稍優(yōu)于CGAAP的血管活性(EC50=1.19 mmol/L),同時，HAGR和CGAAP遠強于F3組分的血管舒張活性。這一點與ACE抑制率并不完全一致,說明雖然所研究的發(fā)酵大豆豆粕提取物具有心血管活性,但其血管活性強度與ACE抑制活性并不直接相關,可能是活性機理不僅僅局限于ACE抑制這單一的一種機制,還有其他未闡明的機理共同作用下,顯示為宏觀上的具體差異。

圖4 CGAAP和HAGR對1 μmol/L PE收縮過的 大鼠主動脈心血管環(huán)的舒張作用Fig.4 Relaxaton of CGAAP and HAGR in 1 μmol/L phenyleohrine-contracted aorta ring

3 結論

豆粕發(fā)酵產物經超濾得到3個不同分子質量的組分F1、F2、F3,其中,ACE抑制活性隨著分子質量的減小而增大,分子質量小于500 Da的F3組分顯示了最高的ACE抑制活性,隨后對F3組分進行GFC、HPLC的分離純化,鑒定出兩個小肽P2-1-2、P3-1-3的序列結構分別為HAGR和CGAAP,并對它們進行了ACE抑制活性和血管活性的分析,HAGR的ACE抑制活性明顯低于小肽CGAAP的ACE抑制活性,而后者擁有77.79%的ACE抑制率。血管活性結果顯示了不同的趨勢,證實了豆粕發(fā)酵酶解分離的部分小肽具有血管活性,但與ACE抑制活性并不直接相關,還有其他活性機理等待后續(xù)研究。

[1]Zhang J H,Tatsumi E,Ding C H,et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides in douchi,a Chinese traditional fermented soybean product[J]. Food Chemistry,2006,98(3):551-557.

[2]Shinjoung R,Jisoo L,Yongil C,et al. Purification and identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from fermented soybean extract[J]. Process Biochemistry,2009,44(4):490-493.

[3]Sanjukta S,Rai A K. Production of bioactive peptides during soybean fermentation and their potential health benefits[J]. Trends in Food Science & Technology,2016,50:1-10.

[4]Okamoto A,Hanagata H,Matsumoto E,et al. Angiotensin I converting enzyme inhibitory activities of various fermented foods[J]. Bioscience Biotechnology & Biochemistry,1995,59(6):1147-1149.

[5]Yimit D,Hoxur P,Amat N,et al. Effects of soybean peptide on immune function,brain function,and neurochemistry in healthy volunteers[J]. Nutrition,2012,28(2):154-159.

[6]Rayaprolu S J,Hettiarachchy N S,Chen P,et al. Peptides derived from high oleic acid soybean meals inhibit colon,liver and lung cancer cell growth[J]. Food Research International,2013,50(1):282-288.

[7]Puchalska P,Concepción G M,Luisa M M. Identification of native angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptides in commercial soybean based infant formulas using HPLC-Q-ToF-MS[J]. Food Chemistry,2014,157(11):62-69.

[8]Liu H,Lv Y,Xu J,et al. Soybean peptide aggregates improved calcium binding capacity[J]. LWT-Food Science and Technology,2016,67(ISSN):174-180.

[9]Thanutchaporn K,Zheng-Quan W,Shinya M,et al. Identification of peptides from soybean protein,glycinin,possessing suppression of intracellular Ca2+concentration in vascular smooth muscle cells[J]. Food Chemistry,2014,152(152):218-224.

[10]Lammi C,Zanoni C,Arnoldi A. IAVPGEVA,IAVPTGVA,and LPYP,three peptides from soy glycinin,modulate cholesterol metabolism in HepG2 cells through the activation of the LDLR-SREBP2 pathway[J]. Journal of Functional Foods,2015,14:469-478.

[11]溫雪琴,劉屾,黃弢,等. 大豆粕堿性蛋白酶水解肽及ACE抑制活性的研究[J]. 食品研究與開發(fā),2014(9):9-12.

[12]田中原,王亞萍,劉屾,等. 堿性蛋白酶水解豆粕制備ACE抑制肽水解條件的優(yōu)化[J]. 天津師范大學學報:自然版,2016,36(3):64-68.

[13]李慶波,刁靜靜,井雪蓮,等. 綠豆渣ACE抑制肽的純化鑒定及構效關系初探[J]. 農產品加工:學刊,2014(21):5-9.

[14]Puchalska P,García M C,Marina M L. Development of a capillary high performance liquid chromatography-ion trap-mass spectrometry method for the determination of VLIVP antihypertensive peptide in soybean crops[J]. Journal of Chromatography A,2014,1338(7):85-91.

[15]Kuroda M,Kato Y,Yamazaki J,et al. Determination and quantification of the kokumi peptide,γ-glutamyl-valyl-glycine,in commercial soy sauces[J]. Food Chemistry,2013,141(2):823.

[16]張雁平. 采用發(fā)酵法工業(yè)化生產大豆蛋白活性肽[J]. 大豆科技,2003(3):26-27.

[17]王喜波,遲玉杰,孫波. 大豆分離蛋白ACE活性抑制肽的研究[J]. 中國糧油學報,2009,24(11):33-37.

[18]劉健敏,鐘芳,麻建國. 大豆生理活性肽的研究(Ⅱ)-抗氧化性和ACE抑制活性的初步研究[J]. 食品與生物技術學報,2004,23(4):50-55.

[19]Coscueta E R,Amorim M M,Voss G B,et al. Bioactive properties of peptides obtained from Argentinian defatted soy flour protein by Corolase PP hydrolysis ☆[J]. Food Chemistry,2016,198:36-44.

[20]李風娟,劉婉璐,方元元,等. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆過程中水提物的ACE抑制活性的變化[J]. 天津科技大學學報,2015(3):24-28.

[21]Chiang W D,Tsou M J,Tsai Z Y,et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor[J]. Food Chemistry,2006,98(4):725-732.

[22]富校軼,高永欣,張佰榮,等. 大豆肽的制備、提取與結構鑒定研究進展[J]. 吉林醫(yī)藥學院學報,2014,35(1):51-54.

[23]范遠景,姬瑩瑩,張焱. 大豆蛋白酶解肽的分子量分布及抑制ACE活性關系研究[J]. 食品科學,2007,28(10):57-61.

[24]Ferreira S H. A Bradykinin-potentiating factor(bpf)present in the venom of bothrops jararca[J]. British Journal of Pharmacology,1965,24(1):163.

[25]Cushman D W,Cheung H S. Spectrophotometric assay and properties of the angiotensin-converting enzyme of rabbit lung[J].Biochemical Pharmacology,1971,20(7):1637-1648.

[26]Hyun C K,Shin H K. Utilization of bovine blood plasma proteins for the production of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides[J]. Process Biochemistry,2000,36(1-2):65-71.

[27]李笑梅. 具有抑制ACE活性的豆醬發(fā)酵條件研究[J]. 食品工業(yè)科技,2010(9):153-154.

[28]于勝男,吳非. 制備大豆降血壓肽最佳用酶的篩選[J]. 食品工業(yè)科技,2010(5):199-201.

[29]王建國,閆冰雨,雷楗勇,等. 合成二肽ACE抑制活性及抗高血壓初步研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(4):160-164.

[30]杭梅,趙新淮. 毛豆腐的毛霉發(fā)酵與其提取物的體外ACE抑制活性[J]. 食品工業(yè)科技,2011(11):187-190.

[31]Yust M M,Pedroche J,Gironcalle J,et al. Production of ace inhibitory peptides by digestion of chickpea legumin with alcalase[J]. Food Chemistry,2003,81(3):363-369.

[32]Gobbetti M,Ferranti P,Smacchi E,et al. Production of angiotensin-I-converting-enzyme-inhibitory peptides in fermented milks started byLactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus SS1 andLactococcuslactissubsp. cremoris FT4[J]. Applied & Environmental Microbiology,2000,66(9):3898.