利用大豆油脫臭餾出物酶法合成植物甾醇酯

林惠穎,辛嘉英,2,*,么婷婷,韓 雪,陳書明

(1.哈爾濱商業大學,食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.中國科學院,蘭州化學物理研究所,羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000; 3.山西農業大學動物科技學院,山西太谷 030801)

植物甾醇,是植物體中一種類環狀醇結構的生物活性物質,具有降低機體膽固醇水平、保護心血管[1],預防冠狀動脈粥樣硬化作用。同時其較高的滲透性可保持皮膚水分,促進皮膚新陳代謝、抑制皮膚炎癥等。但其脂溶性和水溶性有限,反應活性較差,反應時需要大劑量進行,因而限制了其應用發展[2]。與游離的植物甾醇相比,植物甾醇與脂肪酸酯化而成的植物甾醇酯具有較好的溶解性和兼容性[3],因而在醫藥、食品、化妝品等領域廣泛應用。

大豆油脫臭餾出物(SODD)是大豆油精煉加工工序中利用油脂中嗅味物質與脂肪酸甘油酯高溫下揮發程度的差異,水蒸氣蒸餾收集得到的物質[4],其中富含游離脂肪酸、植物甾醇、生育酚、甘油酯以及其他物質。大豆經處理加工后,脫臭餾出物很難利用,而且一定程度上對環境造成了污染,然而經適當的分離處理得到的植物甾醇和脂肪酸是酯化合成植物甾醇酯的理想原料,同時為植物甾醇酯的綠色合成、大豆油脫臭餾出物的合理利用提供了新的思路。

近年來,植物甾醇酯的生理功能及保健功效逐漸被人們熟知,對富含植物甾醇酯的功能性食品的需求也越來越高。傳統的植物甾醇酯的制取主要采用化學合成法,如酯交換法、羧酸直接酯化法、酸酐酯化法以及羧酸酰氯酯化法等,但化學法合成植物甾醇酯反應溫度較高,副產物較多;此外,也可以利用酶催化法合成植物甾醇酯,其催化反應條件較溫和,副產物較少,易于產物的分離純化,但需要選擇合適的有機溶劑同時提高酶的穩定性,提高生產效率。

本文從大豆油脫臭餾出物中分離得到植物甾醇和脂肪酸,利用生物酶法催化合成植物甾醇酯,但由于酶在有機試劑中溶解度較差,且易結塊,因此將酶固定在適當載體上,提高酶在有機相中的催化性能和熱穩定性,同時有利于酶的回收。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆油脫臭餾出物 九三豆油公司提供;丙酮、甲醇、正己烷 分析純,天津渤海化工股份有限公司;氫氧化鈉、氫氧化鉀 分析純,天津富宇精細化工有限公司;硅藻土、活性炭、大孔樹脂HP20 日本三菱化成公司;薄層層析硅膠 青島海洋化工廠;柱狀假絲酵母酵母脂肪酶CRL Sigma公司;植物甾醇標品 浙江大為藥業有限公司;油酸標品 天津渤海化工股份有限公司。

BSA220S-CW型精密天平 Sartorius公司;KH-2000型薄層色譜儀 上海科賀生化科技有限公司;C97951型紅外光譜儀 Sartorius公司;RV8V型旋轉蒸發儀 德國IKA公司;UV-2550型紫外-可見分光光度計 上海一恒科技有限公司;HL-2S型恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆油脫臭餾出物的酶法水解 稱取5 g脫臭餾出物,加入到25 mL帶塞磨口錐形瓶中,加入30%的水,恒溫預熱并搖勻。然后加入25 U/g底物的假絲酵母脂肪酶(CRL),搖勻,使其充分混合,將錐形瓶置于恒溫搖床中,45 ℃,200 r/min,反應12 h。反應結束后,反應液置于水浴中高溫滅酶并破乳,過濾去除脂肪酶。待油水兩相明顯分層后,用滴管吸取上層油相,甘油經水洗分層去除。

1.2.2 溶析冷卻結晶法提取植物甾醇 在水解后脫臭餾出物中,加入一定比例的丙酮-甲醇混合溶劑,溶劑與原料以一定的比例混合,在50 ℃的水浴中溶解。30 min后混合均勻,冷卻至室溫。在-20 ℃的冰箱中冷卻結晶一定的時間后,取出迅速抽濾,用有機溶劑洗滌甾醇粗品來精制,在一定溫度熱水浴中浸泡一段時間,抽濾,可將甾醇酯完全除去[5]。濾餅真空干燥,濾液收集。分別設置丙酮-甲醇比為4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4 (V/V),溶劑原料比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1 (V/W)以及甲醇、乙醇、丙酮、正己烷四種洗滌劑,考察不同溶劑比、溶劑原料比以及洗滌劑對甾醇得率的影響,計算公式如下

1.2.3 甾醇紅外光譜分析 稱取0.25 g溴化鉀置于100 ℃烘箱中充分干燥,隨后置于研缽中充分研磨,將研磨后的溴化鉀放入壓片機中壓片,進行背景掃描。取少量甾醇置于溴化鉀中充分研磨,壓片,將制備得到的樣品置于紅外光譜中,4000～500 cm-1范圍內掃描,進行紅外分析。

1.2.4 脂肪酸的分離提取 將上一步收集的濾液旋轉蒸發,除去有機溶劑。然后稱取5 g,用0.5 mol/L的氫氧化鉀-乙醇溶液在室溫下皂化24～48 h(加入過量氫氧化鉀),直到油滴完全消失為止[6]。真空抽濾,除去不皂化物,可將甾醇酯完全除去,加入1 mol/L濃鹽酸溶液至pH為2,用正己烷(5～10 mL)萃取脂肪酸,用分液漏斗除去水相,用旋轉蒸發儀將正己烷除去,即得到脂肪酸[6]。

1.2.5 脂肪酸紅外光譜分析 取少量脂肪酸置于制備好的溴化鉀中充分研磨、壓片,紅外光譜分析檢測,具體操作同1.2.3。

1.2.6 CRL脂肪酶的固定 CRL脂肪酶溶于一定量的正己烷中,并加入一定量的載體[7-8](硅藻土、分子篩粉末、活性炭粉末、柱層析硅膠及大孔樹脂,酶粉∶載體=1∶10,W/W),80 r/min、30 ℃條件下吸附1 h,過濾,用緩沖溶液沖洗3遍,收集濾液,抽濾,40 ℃除水干燥。固定化的酶及濾液在0～4 ℃冰箱中儲存,備用[9-10]。

1.2.7 擔載率和酶活力的測定 將磷酸緩沖溶液固定化酶過程中的濾液(包括洗滌固定化酶的緩沖液)稀釋十倍,用紫外-可見分光光度計測定CRL酶溶液280 nm下的吸光值,以確定其蛋白含量。計算公式如下:

擔載率(%)=(固定化之前酶溶液蛋白含量-固定化之后殘液蛋白含量)/固定化之前酶溶液蛋白含量×100

采用橄欖油乳化法,以空白樣組作對照。水解橄欖油每分鐘產生1 μmol游離的脂肪酸定義為一個酶活力(U)。

1.2.8 植物甾醇酯的酶法合成 合成大豆油脫臭餾出物中分離得到的脂肪酸1 g,分離得到的植物甾醇0.5 g,加入一定量的固定化酶,正己烷5 mL,45 ℃,150 r/min搖床反應25 h[9-11]。

1.2.9 植物甾醇酯紅外光譜分析 植物甾醇酯置于制備好的溴化鉀中充分研磨,壓片,紅外光譜分析檢測,具體操作同1.2.3。

1.2.10 薄層色譜分離鑒定 微量進樣器分別吸取油酸標樣、脫臭餾出物中提取的脂肪酸、植物甾醇標樣、脫臭餾出物中提取的甾醇以及通過酶法合成的植物甾醇酯,點涂在事先制備的層析硅膠與1%羧甲基纖維素鈉混合(質量比1∶3)的層析板上,層析展開劑為正己烷∶無水乙醚∶冰乙酸=90∶10∶1 (v/v/v),室溫下展開約20 min,晾干,用碘液熏蒸10 min顯色,放入薄層色譜掃描儀中進行分析。根據峰面積計算酯化率,公式如下:

酯化率(%)=植物甾醇酯峰面積/(1.643×植物甾醇峰面積+植物甾醇酯峰面積)×100

式中:1.643為甾醇與甾醇酯之間的轉換系數(甾醇酯的相對分子質量/甾醇的相對分子質量)。

2 結果與討論

2.1 影響植物甾醇提取的因素

2.1.1 混合溶劑比例對植物甾醇提取的影響 植物甾醇在丙酮中的溶解度隨溫度變化較明顯,通過降溫很容易結晶析出,但色素等雜質也易溶于丙酮且不易析出。因此選用對甾醇溶解度很小的甲醇,與丙酮配成丙酮-甲醇混合溶劑,改善溶解平衡關系和結晶條件。

由于甾醇在甲醇中的溶解度較小,因此在混合溶劑中甲醇比例較大時,甾醇的析出量較少,混合溶劑中丙酮的比例逐漸增大,甾醇的析出量逐漸增多,當混合溶劑中甲醇與丙酮比例為1∶2 (V/V)時,甾醇析出量達到最大,但當混合溶劑中丙酮的比例繼續增加時,甾醇的析出量逐漸減少,直至沒有甾醇析出,這是因為丙酮對甾醇的溶解度較大,混合溶劑中丙酮的比例過大時,甾醇全部溶解于丙酮中,無法冷卻結晶析出,結果如圖1所示,因此,混合溶劑中甲醇與丙酮最佳比例為1∶2 (V/V)。

圖1 混合溶劑對甾醇得率的影響Fig.1 The effect of the ratio of mixed solvent on the extraction of phytosterol

2.1.2 溶劑原料比對甾醇提取的影響 隨著溶劑的比例逐漸加大,甾醇的析出量逐漸增加,在溶劑原料比為3∶1 (V/W)時,甾醇析出量達到最大;但當溶劑的比例繼續增加時,甾醇的析出量反而逐漸減少。這可能是因為溶劑用量較小時,原料酶解液粘度仍然很大,處于過度飽和的狀態,對植物甾醇的結晶產生一定的阻礙,植物甾醇結晶速度慢[12]。然而,當溶劑用量過大時,原料酶解液粘度降低了,過飽和程度降低,結晶和除雜效果很好,但甾醇被溶解的量增多,同時對甾醇也有一定的損耗,結果如圖2所示,因此,溶劑原料比為3∶1 (V/W)為提取甾醇的最優條件。

圖2 溶劑原料比對甾醇得率的影響Fig.2 The effect of the ratio of solvent to material on the extraction of phytosterol

2.1.3 粗甾醇洗滌劑對甾醇提取的影響 洗滌植物甾醇要求溶劑要對色素等雜質的溶解度大,對植物甾醇的溶解度小。本實驗選擇了正己烷、甲醇、乙醇和丙酮這幾種常見的有機溶劑作為洗滌溶劑。結果如圖3所示,在相同條件下,經正己烷洗滌的甾醇析出量最大,而丙酮洗滌后幾乎沒有甾醇析出,這是因為甾醇溶解于丙酮中。因此,洗滌粗甾醇的最佳溶劑為正己烷。

圖3 粗甾醇洗滌劑對甾醇得率的影響Fig.3 The effect of detergent on the extraction of phytosterol

2.2 植物甾醇的紅外定性分析

在最優提取條件下(甲醇-丙酮混合溶劑的比例為1∶2 (V/V),溶劑原料比為3∶1 (V/W),洗滌粗甾醇的溶劑為正己烷)提取大豆油脫臭餾出物中的植物甾醇,與植物甾醇標樣對照,結果如圖4所示。參考文獻[13-14]可知，-OH的伸縮振動峰出現在3700～3200 cm-1,圖4分離產物的紅外圖譜中,3367 cm-1處存在植物甾醇特征吸收峰-OH,且與植物甾醇標準品對照相比,大體一致,-OH特征峰出峰位置大體相同,因此初步確定大豆油脫臭餾出物中分離提取得到的樣品可能為植物甾醇。

圖4 植物甾醇標樣與提取的甾醇紅外圖譜對比Fig.4 The FTIR contrast of standard sample of phytosterol and extracted phytosterol

2.3 脂肪酸的紅外定性分析

對大豆油脫臭餾出物中提取的脂肪酸做紅外光譜分析,以油酸的紅外圖譜作對照。如圖5所示,大豆油脫臭餾出物中的脂肪酸主要為不飽和脂肪酸：油酸、亞油酸,與油酸標準品紅外圖進行比對基本一致,且1725～1750cm-1范圍內沒有酯鍵的官能團特征峰[15]。

圖5 油酸標樣與提取的脂肪酸紅外圖譜對比Fig.5 The FTIR contrast of standard sample of oleic acid and extracted fatty acid

2.4 CRL脂肪酶的固定化

選用5種載體分別在正己烷中進行CRL脂肪酶的固定化處理,測定了不同條件下載體對脂肪酶的固載情況即擔載率以及固定化酶的酶活,結果如圖6、圖7所示。

圖6 不同載體固定化酶的擔載率Fig.6 The immobilization degree of different carriers

圖7 不同載體固定化酶的酶活力Fig.7 The enzyme activity of different carriers

脂肪酶在有機相中與水相中不同,脂肪酶不溶于有機試劑,載體表面形成的水膜促使脂肪酶只能存在于載體的水膜內,因此有利于脂肪酶的固定化,這種方法也被稱為游離固定化[16-17],即不需要通過任何的鍵合手段就可以將脂肪酶固定在載體表面上。此外,幾種載體中大孔樹脂固定化酶的擔載率最高,且酶活力相對較高,因此選用大孔樹脂固定CRL脂肪酶。

2.5 植物甾醇酯的合成

從大豆油脫臭餾出物酶解液中經溶析冷卻結晶提取植物甾醇,與之后從提取植物甾醇后的濾液中分離得到的脂肪酸,在大孔樹脂固定化酶的催化作用下酯化反應。

2.5.1 紅外光譜分析 圖8酯化產物的紅外光譜中,4000～3000 cm-1范圍內不存在-OH的伸縮振動[13-14],意味著經酯化反應的分離操作后,產物中不存在游離的植物甾醇。1725～1750 cm-1為酯鍵的官能團特征吸收峰[15],不難發現在酯化產物光譜的1734 cm-1處新出現了很明顯的吸收峰,為酯鍵的特征峰,由此可以判定產物中有酯鍵,結合薄層色譜的分析結果,確定產物為植物甾醇脂肪酸酯。

圖8 酶法合成的植物甾醇脂肪酸酯的紅外圖譜Fig.8 The FTIR result of enzymatic synthesized phytosterol ester

2.5.2 薄層色譜分析 圖9所示,大豆油脫臭餾出物中提取的脂肪酸和植物甾醇在薄層硅膠板上與油酸和植物甾醇的標樣出現的位置大體一致,Rf值相同,可確定提取物與標樣為同種物質。植物甾醇脂肪酸酯反應液位置在薄層硅膠板最上方部位有新的物質出現,由于植物甾醇酯Rf值要大于反應底物脂肪酸和植物甾醇,且植物甾醇酯的擴散速度比反應底物脂肪酸和植物甾醇快,因此初步判定出現的新物質為植物甾醇脂肪酸酯。而在提取的脂肪酸和植物甾醇位置上方沒有與植物甾醇酯Rf值相同的物質出現,這也表明了從大豆油脫臭餾出物中提取的脂肪酸和植物甾醇純度較好,沒有植物甾醇酯的存在。而且不難發現,酯化反應后,薄層硅膠板上底物的顏色變淺、面積變小,底物大部分已經被反應,但因在實驗中脂肪酸的含量相對植物甾醇過量,因此有一些脂肪酸殘留,經計算酯化率為45.11%。

圖9 反應液薄層色譜圖Fig.9 The TLC result of sample注：1.油酸標樣;2.脫臭餾出物中提取的脂肪酸; 3.植物甾醇標樣;4.脫臭餾出物中提取的甾醇; 5.脫臭餾出物中提取的脂肪酸和 甾醇通過酶法合成的植物甾醇脂肪酸酯。

3 結論

從大豆油脫臭餾出物酶解液中經溶析冷卻結晶提取植物甾醇,考察了混合溶劑比例、溶劑原料比、洗滌粗甾醇的溶劑對植物甾醇提取的影響,確定最佳提取工藝為:甲醇-丙酮混合溶劑的比例為1∶2 (V/V),溶劑原料比為3∶1 (V/W),洗滌粗甾醇的溶劑為正己烷。然后再從提取植物甾醇后的濾液中分離得到脂肪酸,并選用大孔樹脂作為載體的固定化酶催化,兩者進行酯化反應合成植物甾醇酯。根據薄層色譜鑒定,初步判定酯化反應有新的物質生成,再用紅外光譜分析,產物紅外圖譜中,1734 cm-1處存在酯鍵的官能團特征吸收峰,證明了從脫臭餾出物中提取的植物甾醇和脂肪酸,在非水相中經脂肪酶催化合成產物為植物甾醇酯[18-20],可用于日后食品、醫療、化妝品等各個方面。

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