兩種真姬菇不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

劉繼攀,張紫華,關振華,劉文君,李佳歡,2,金文松,2,*,胡開輝,2,*

(1.福建農林大學生命科學學院,福建福州 350002; 2.福建農林大學(古田)菌業研究院,福建寧德 352200)

自由基、化學反應和各種化合物的氧化還原反應可能導致蛋白質的變性、DNA損傷以及肝細胞中的脂質過氧化作用[1],而這些反應與許多慢性疾病,如糖尿病、癌癥、動脈粥樣硬化、心血管疾病等密切相關[2]。天然抗氧化劑廣泛存在于水果、茶葉、蔬菜、谷物與藥用植物中。天然抗氧化劑具有清除自由基的能力,更為重要的是,相較于合成型抗氧化劑，比如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)與叔丁基對苯二酚(TBHQ),天然抗氧化劑被認為是一種低毒,甚至無毒型的抗氧化劑。因此,從各種食用菌中發掘天然抗氧化劑成為食品科學領域的一個研究熱點。

真姬菇(Hypsizygusmarmoreus),學名斑玉蕈,是一種高蛋白、低脂肪、低熱量的食藥兼用菌[3]。Yu等[4]采用共軛二烯、DPPH自由基清除能力、還原力、羥基自由基清除能力、亞鐵離子螯合能力及銅離子螯合能力的方法分別對真姬菇甲醇、冷水與熱水粗提物的抗氧化活性進行了分析,發現真姬菇的三種粗提物均具有一定的抗氧化活性。另外一項研究成果同樣來自于Yu等[5],他們分析了真姬菇白色變種的甲醇與熱水粗提物的抗氧化活性,研究發現真姬菇白色變種的甲醇與熱水粗提物也均具有一定的抗氧化活性。通過測定甲醇與熱水粗提物中β-胡蘿卜素、α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚與多酚的含量,結合甲醇與熱水粗提物的抗氧化活性數據,分析了粗提物中β-胡蘿卜素、α-生育酚、δ-生育酚、γ-生育酚與多酚含量分別與抗氧化活性之間的相關性。同時,這兩項研究結果表明真姬菇不同品種之間所含的抗氧化物質種類、抗氧化物質含量可能存在很大的差異。王麗威等[6]通過提取真姬菇多酚粗提物,發現真姬菇多酚具有清除DPPH自由基的能力。前人的研究成果表明盡管不同品種的真姬菇所含的抗氧化物質可能存在較大差異,但都具有一定的抗氧化活性。

本課題組應用原生質體融合技術融合真姬菇與鳳尾菇的原生質體,基于漆酶篩選體系,獲得一株新的真姬菇高產菌株[7]并命名為閩真2號。應用白玉菇和灰蟹菇作為親本,結合分子標記和原生質體單核化雜交育種技術選育出生產性狀優良的真姬菇新菌株并命名為閩真3號。本研究采用80%甲醇分別對閩真2號真姬菇與閩真3號真姬菇進行浸提,再分別用正已烷、乙酸乙酯、正丁醇對粗提物進行萃取。應用DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力與總抗氧化能力的方法分析閩真2號真姬菇與閩真3號真姬菇各種萃取物的抗氧化活性。研究結果將為閩真2號真姬菇與閩真3號真姬菇作為天然抗氧化劑的開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

閩真2號真姬菇、閩真3號真姬菇 由福建古田福泉鑫生物科技有限公司提供,烘干、粉碎后裝于密封袋中備用;沒食子酸(純度≥99.0%) 上海麥克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,純度≥97.0%) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS,純度≥98.0%) 北京索萊寶科技有限公司;甲醇、十二水合磷酸鈉、濃硫酸、無水碳酸鈉、Folin-Ciocalteu試劑、四水合鉬酸銨等藥品 均為國產分析純。

N-1300D型旋轉蒸發儀 上海愛朗儀器有限公司;3020型多功能酶標儀 賽默飛世爾科技公司;CA-1115A型冷卻水循環裝置 上海愛朗儀器有限公司;LGJ-12型真空冷凍干燥機 北京松源華興科技有限公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技儀器有限公司;HZC-250型全溫振蕩培養箱 蘇州培英實驗設備有限公司;AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取物的制備 真姬菇鮮品在50 ℃條件下,烘24 h使其干燥,粉碎,過60目篩,制得真姬菇干粉。通過預實驗可知80%甲醇作為提取劑時,抗氧化活性比較強;液料比為8∶1 (mL∶g)時,提取率較高。為此,稱取100 g干粉,放入1 L的三角瓶中,加入800 mL體積分數為80%的甲醇,液料比8∶1 (mL∶g),置于40 ℃的恒溫搖床(180 r/min)浸提8 h,抽濾得到提取液,浸提操作重復3次,合并提取液,旋蒸濃縮,浸膏置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥,制得真姬菇粗提物。

將粗提物用適量蒸餾水懸浮,將其倒入分液漏斗中,按體積比1∶1加入正己烷,振蕩,靜止12 h,分液,上層液體倒入燒杯中,得到正己烷萃取液,下層液體按體積比1∶1加入新的正己烷,正己烷萃取操作重復3次,合并正己烷萃取液,旋蒸濃縮,浸膏置于真空冷凍干燥機中冷凍干燥得到正己烷萃取物。采用相同的技術路線制備乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物;正丁醇萃余物為水萃取物[8]。最后稱取各種萃取物的質量,并計算不同溶劑提取物的提取率,計算公式如下:

式中:m1為不同溶劑萃取物的質量(mg);m2為粗提物的質量(mg)。

1.2.2 抗氧化活性的測定

1.2.2.1 總抗氧化能力的測定 按照梁引庫等[9]的測定方法,磷鉬試劑的配制:分別稱取1.064 g十二水合磷酸鈉、0.494 g四水合鉬酸銨、3.335 mL濃硫酸共同溶于100 mL水中,混合均勻,使其濃度依次為28,4 mmol/L和0.6 mol/L。配制不同質量濃度的萃取物,將0.2 mL待測樣品加入到1.8 mL磷鉬試劑中,將混合液混勻并置于95 ℃恒溫水浴鍋中水浴90 min,反應液冷卻后取200 μL置于695 nm處測定吸光值,平行測定3次,取其平均值。

1.2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定 測定方法參考Ma,Ke等[10]文獻的報道,稍作改動。將100 μL不同質量濃度的萃取物與100 μL的甲醇-DPPH自由基(終濃度為0.1 mmol/L)充分混勻后,避光處反應30 min,最后用多功能酶標儀在517 nm處測定反應體系的吸光值,平行測定3次,取其平均值。DPPH自由基清除率的計算公式為:清除率(%)=[(A517 nm空白對照-A517樣品)/A517 nm空白對照]×100。

1.2.2.3 ABTS自由基清除能力的測定 根據Ksouri R等[11]的方法進行測定,稍作改動。吸取5 mL,14 mmol/L的ABTS和5 mL,4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液,振蕩混勻,使其終濃度分別為7.0、2.45 mmol/L的儲備液,并將該儲備液于室溫下暗處靜置12～16 h。將生成的儲備液用80%甲醇稀釋至734 nm處吸光值為0.7±0.02的工作液。反應體系于96孔板中加入20 μL不同質量濃度的萃取物,再加入180 μL ABTS工作液,于室溫下避光反應10 min,測定反應液在734 nm處的吸光值,平行測定3次,取其平均值。計算ABTS自由基清除率,公式如下:ABTS自由基清除率(%)=(1-A734 nm樣品/A734 nm空白對照)×100。

1.2.3 多酚含量的測定 測定方法參照張梅梅等[12]的文獻,準確配制0.08 mg/mL沒食子酸標準液,分別吸取沒食子酸標準液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL,加入0.3 mL 1.0 mol/L Folin-Ciocalteu試劑,避光反應8 min,再加入0.6 mL 10%(M/V)Na2CO3溶液,混勻后室溫下避光反應30 min,用去離子水定容至5.0 mL,于750 nm處測定吸光值。平行測定3次,取其平均值。以反應體系中沒食子酸標準品溶液的濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標作標準曲線,回歸方程為:y=0.1047x+0.0153,R2=0.9986。取不同溶劑萃取物測定多酚含量,根據標準曲線回歸方程式計算多酚含量,其結果表示為每克萃取物中沒食子酸的當量毫克數(gallic acid equivalent,GAE),即mg GAE。

1.2.4 數據處理 采用Origin 8.5和SPSS 21.0數據處理軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 真姬菇不同溶劑萃取物提取率

由表1可知,閩真2號與閩真3號粗提物的提取率分別為46.30%、51.33%,粗提物經正已烷、乙酸乙酯與正丁醇萃取后,不同極性的物質在不同的有機萃取劑中呈現相同的分布趨勢,萃取率由大到小為:水萃取物>正己烷萃取物>正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物。閩真2號與閩真3號水萃取物的萃取率分別達到83.84%、86.85%,說明真姬菇粗提物主要由大極性的物質構成。

表1 不同溶劑萃取物的提取率(%)Table 1 The extraction yields of various solvent extracts(%)

2.2 真姬菇不同溶劑萃取物抗氧化活性的測定

2.2.1 總抗氧化能力的測定 由圖1可知,閩真2號和閩真3號粗提物與四種萃取物的濃度在1.25～20 mg/mL范圍內,它們的總抗氧化能力隨著粗提物或萃取物濃度的增加而增加。閩真2號粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物與水萃取物總抗氧化能力的IC50值分別為13.94±0.19、2.18±0.14、2.47±0.09、11.48±0.08與23.98±0.45 mg/mL(表2),其中,正己烷萃取物與乙酸乙酯萃取物的總抗氧化能力之間差異不顯著(p>0.05),但與粗提物、正丁醇萃取物與水萃取物的總抗氧化能力之間差異均達顯著水平(p<0.05)。閩真3號粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物與水萃取物總抗氧化能力的IC50值分別為14.44±0.17、4.10±0.21、3.12±0.05、11.97±0.10與19.76±0.75 mg/mL,且萃取物之間的總抗氧化能力差異均達顯著水平(p<0.05)(表2)。陽性對照維生素C的IC50值為0.16±0.002 mg/mL(表2)。閩真2號正己烷萃取物的總抗氧化能力最強,而閩真3號乙酸乙酯萃取物的總抗氧化能力最強。在總抗氧化能力方面,閩真2號稍微優于閩真3號,但都明顯弱于維生素C。此外,實驗結果也表明閩真2號和閩真3號發揮總抗氧化能力的物質主要是中小極性的物質,較大極性物質的總抗氧化能力弱。

圖1 閩真2號和閩真3號各萃取物的總抗氧化能力分析Fig.1 Assays for total antioxidant activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.2.2 DPPH自由基清除能力的測定 由圖2可知,除正丁醇萃取物之外,粗提物、正已烷萃取物、乙酸乙酯萃取物與水萃取物清除DPPH自由基的能力均隨著測試物濃度的增加而增加。閩真2號粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物與水萃取物清除DPPH自由基的IC50值分別為5.84±0.17、4.97±0.15、3.46±0.25與6.94±0.10 mg/mL,在測試的濃度范圍之內,正丁醇萃取物對DPPH自由基的清除率未達50%,各種萃取物清除DPPH自由基能力之間的差異性均達顯著水平(p<0.05),其中乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的效果最好(表2)。閩真3號粗提物、正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物與水萃取物清除DPPH自由基的IC50值分別為6.07±0.31、4.74±0.02、0.83±0.01、1.96±0.11與3.57±0.06 mg/mL,乙酸乙酯萃取物清除DPPH自由基的效果最好(表2)。與總抗氧化能力分析結果相同,閩真2號清除DPPH自由基的能力強于閩真3號清除DPPH自由基的能力(表2),但是兩者清除DPPH自由基的能力都弱于維生素C。然而,閩真2號和閩真3號各種萃取物清除DPPH自由基能力的趨勢不同,閩真2號各種萃取物清除DPPH自由基能力的趨勢為:乙酸乙酯萃取物>正己烷萃取物>粗提物>水萃取物>正丁醇萃取物,閩真3號各種萃取物清除DPPH自由基能力的趨勢為:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>水萃取物>正己烷萃取物>粗提物。實驗結果表明閩真2號和閩真3號中具有清除DPPH自由基的物質都是中小極性的化合物。

表2 不同溶劑萃取物抗氧化活性的IC50值(mg/mL)Table 2 IC50 values of antioxidant properties of various solvent extracts(mg/mL)

圖2 閩真2號和閩真3號各萃取物 清除DPPH自由基的能力分析Fig.2 Assays for DPPH radical scavenging activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.2.3 ABTS自由基清除能力的測定 如圖3所示,各種萃取物對ABTS自由基均表現出良好的清除能力,且清除能力成量效正相關。閩真2號各種萃取物清除ABTS自由基能力的趨勢為:正丁醇萃取物>水萃取物>粗提物>乙酸乙酯萃取物>正已烷萃取物;閩真3號各種萃取物清除ABTS自由基能力的趨勢為:乙酸乙酯萃取>正丁醇萃取物>水萃取物>粗提物>正已烷萃取物(表2)。就清除ABTS自由基能力而言,閩真3號優于閩真2號,但是兩者都弱于維生素C。實驗結果表明閩真2號和閩真3號中具有清除ABTS自由基的物質主要為中大極性的物質,小極性物質清除ABTS自由基的能力較弱。

圖3 閩真2號和閩真3號各萃取物 清除ABTS自由基的能力分析Fig.3 Assays for ABTS radical scavenging activities of various solvent extracts of MinZhen No.2 and MinZhen No.3

2.3 真姬菇不同溶劑萃取物多酚含量

可食用或者不可食用的真菌通常發現包含多種類型的多酚。據報導多酚具有多種生物學功能,包括抗氧化活性,多酚的抗氧化活性主要由于它們的氧化還原特性決定的[13]。本研究以沒食子酸為標準物,Folin-Ciocalteu法分別測定閩真2號與閩真3號各種萃取物中多酚的含量,以期分析萃取物多酚含量與萃取物的抗氧化活性之間的相關性。閩真2號各種萃取物多酚含量的趨勢為:正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>正己烷萃取物>粗提物>水萃取物;閩真3號各種萃取物多酚含量的趨勢為:乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>粗提物>正己烷萃取物>水萃取物(表3)。閩真3號多酚含量稍微多于閩真2號多酚含量。

表3 不同溶劑萃取物的多酚含量(mg/g萃取物)Table 3 Total polyphenol contents of various solvent extracts(mg/g extracts)

2.4 抗氧化活性與多酚含量的相關性

線性回歸分析萃取物多酚含量與萃取物的抗氧化活性之間的相關性,結果表明閩真2號多酚含量和總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的相關系數分別為0.1665、0.7701、0.1386;閩真3號多酚含量和總抗氧化能力、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力的相關系數分別為0.2743、0.7954、0.4230。相關性分析結果表明多酚含量與清除DPPH自由基能力之間具有較好的相關性,說明萃取物中多酚是發揮清除DPPH自由基的主要成分;然而,多酚含量與總抗氧化能力、清除ABTS自由基能力之間的相關性較差(表4),說明萃取物中發揮總抗氧能力與清除ABTS自由基能力可能主要是非多酚物質,如萜類化合物、生育酚等。

表4 抗氧化活性的IC50值與多酚含量的相關性Table 4 Correlation between IC50 values of antioxidant properties and total polyphenol contents

3 討論與結論

本研究應用80%甲醇浸提真姬菇兩個新品種(閩真2號、閩真3號)中的功能性物質,再用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇分別對粗提物進行萃取,分別制得正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物與水萃取物。由于食用菌提取物的活性物質具有多種成分,粗提物或萃取物的抗氧化活性不能僅僅通過單一方法進行評估,因此本研究采用3種分析方法,包括總抗氧能力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力,分析閩真2號與閩真3號各種萃取物的抗氧化活性。研究結果表明中小極性的物質比中大極性的物質具有較強的總抗氧化能力與清除DPPH自由基能力;而中大極性的物質清除ABTS自由基的能力略優于中小極性的物質清除ABTS自由基能力。盡管水萃取物占總萃取物的比例達80%以上,但其抗氧化活性明顯比正己烷萃取物、乙酸乙酯萃取物與正丁醇萃取物的抗氧化活性弱,表明真姬菇中主要的抗氧化物質成分是中小極性物質。通過測定閩真2號與閩真3號各種萃取物中的多酚含量,結合萃取物的抗氧化活性數據(IC50),分析多酚含量與抗氧化活性之間的相關性。相關性分析結果表明多酚含量僅與清除DPPH自由基能力之間具有較好的相關性,本研究結果與Yu等[5]的研究結果相矛盾,他們分析的真姬菇品種中多酚含量與清除DPPH自由基能力之間不具有相關性,結果差異性可能源自于不同的真姬菇品種所含的多酚類型可能存在差異性。多酚含量與總抗氧化能力之間相關性差,這與Sahreen等[14]的研究結果相一致。據報導,植物提取物中多酚含量與抗氧化活性成正相關[14-17]。然而,多酚含量與抗氧化活性之間的相關性一直存在爭議,正如Maria A等[18]報道的一樣,他們發現甜橙皮不同提取物多酚含量不與它們清除自由基的能力成正比,類似的現象也存在于其他研究成果[5,19]。真姬菇粗提物與四種萃取物中多酚含量與抗氧化活性之間的關系呈現復雜性,導致這種現象的原因可能有以下兩個:不同的萃取溶劑會萃取不同的活性物質,從而導致它們的抗氧化活性呈現差異性;由于用于分析抗氧化活性的方法基于不同的機理與條件,方法之間可能會呈現不同的結果,每一種方法也許只能夠部分地反應測試物的抗氧化活性。

總體而言,閩真2號真姬菇與閩真3號真姬菇的粗提物與四種萃取物都具有一定的抗氧化活性,特別是正己烷萃取物與乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性較好,具有開發成天然抗氧化劑的潛能。

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