南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵過程中品質(zhì)的變化

楊 沖,彭 珍,熊 濤

(南昌大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

我國是柑桔原產(chǎn)地之一,年產(chǎn)量居世界第三位,僅次于巴西、美國[1-2],而江西省作為贛南-湘南-湖南-桂北柑桔帶的優(yōu)勢區(qū),是全國柑桔的重要產(chǎn)地[3],具有豐富的寬皮柑桔資源[4],以贛南特產(chǎn)南豐蜜桔為代表,歷史上就以果色金黃、皮薄肉嫩、食不存渣、風(fēng)味濃甜、芳香撲鼻而聞名中外。有研究表明,蜜桔中富含有機(jī)酸、糖類、VC、VE、β-胡蘿卜素、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素,黃酮類物質(zhì)和檸檬苦素類物質(zhì)則構(gòu)成其特有的苦味成分[5-6]。蜜桔本身具有潤肺、止咳、化痰、健脾、順氣、止渴的藥效[7]。因此,對蜜桔的研究和開發(fā)具有重要的價值。近年來,不僅全汁發(fā)酵的系列柑桔果酒、柑桔白蘭地和柑桔果醋(調(diào)味醋和飲料醋)[8-9]不斷被研發(fā),果膠、香精油、橙皮色素、檸檬苦素等系列高附加值產(chǎn)品也在食品、化工、保健品和化妝品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[[10-12]。但是,關(guān)于系統(tǒng)研究乳酸菌發(fā)酵蜜桔飲料的相關(guān)研究也較少,李輝[13]用酵母菌和乳酸菌復(fù)合發(fā)酵冬棗柑桔汁,得到了冬棗柑桔復(fù)合汁的最佳發(fā)酵工藝;李妍等[14]應(yīng)用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌(1∶1)進(jìn)行發(fā)酵制作乳酸菌發(fā)酵飲料,優(yōu)化發(fā)酵工藝;郭麗等[15]對柑桔乳酸菌飲料的工藝進(jìn)行了研究。相關(guān)文獻(xiàn)多集中在工藝研究,選用的菌種多集中于保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、酵母菌等,而針對乳酸菌單菌發(fā)酵柑桔飲料發(fā)酵前后主要成分的變化的研究較少。

本文首次用乳酸菌單菌發(fā)酵贛南特產(chǎn)南豐蜜桔汁,探究發(fā)酵過程中菌落數(shù)、pH、總酸度、有機(jī)酸和糖類隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律,對發(fā)酵前后維生素C、總黃酮、多酚和氨基酸含量進(jìn)行分析,期望為南豐蜜桔的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南豐蜜桔 產(chǎn)地江西省南豐縣,果形扁圓,果皮薄,均重25 g左右;南豐蜜桔專用乳酸菌劑NCU1125 實(shí)驗(yàn)室篩選菌株真空冷凍干燥法制得;果糖、蔗糖、葡萄糖、草酸、乳酸、蘋果酸、乙酸、檸檬酸(標(biāo)準(zhǔn)品) 索萊寶公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

MideaPHS-25pH型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;WMZK-02型厭氧培養(yǎng)箱 上海華辰醫(yī)用儀器有限公司;TG16-W微量高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;HP1260 高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌發(fā)酵南豐蜜桔的工藝流程 南豐蜜桔→挑選→壓榨→紗布過濾→加7%果葡糖漿調(diào)配→水浴滅菌(95 ℃,25 min)→冷卻至室溫→加入3(m/m)的乳酸菌劑(活菌數(shù)1011CFU/mL)→37 ℃恒溫發(fā)酵(60 h)→發(fā)酵后南豐蜜桔汁原漿→蔗糖調(diào)配→蜜桔飲料[16]。

1.2.2 pH的測定 取5 mL發(fā)酵后的南豐蜜桔汁原漿于小燒杯中,pH計(jì)直接測定。

1.2.3 總酸度的測定 按照GB/T 12456-2008堿滴定法測定發(fā)酵過程中酸度。

1.2.4 菌落數(shù)的測定 平板稀釋活菌計(jì)數(shù)法[17]。取1 mL發(fā)酵液加入到9 mL滅菌冷卻的生理鹽水中,再依次做10倍系列濃度稀釋,選取三個適當(dāng)稀釋梯度的發(fā)酵液,分別吸取這三個稀釋液100 μL于無菌的MRS固體培養(yǎng)基上涂布至稀釋液干燥,將培養(yǎng)皿倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24 h后,選取菌落數(shù)在30～300個之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 有機(jī)酸的測定 參照Xiong T等[18]的方法。

1.2.5.1 流動相的配制 0.5 mol/L的硫酸,超聲波脫氣后備用。

1.2.5.2 色譜條件 AMINEXHPX-87H離子交換柱(300×7.8 mm);流動相為6 mmol/L硫酸溶液,流速為0.5 mL/min,柱溫45 ℃,紫外檢測器檢測波長205 nm;選用示差折光檢測器檢測糖醇(蔗糖、葡萄糖、果糖)含量,紫外檢測器檢測草酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、乙酸的含量。

1.2.6 多酚含量的測定 福林酚法[19-20];總黃酮含量的測定:GB/T 12143附錄G總黃酮的測定;維生素C含量測定:紫外分光光度法[21]。以上每個樣品均重復(fù)3次。

1.2.7 游離氨基酸的測定 根據(jù)GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》,利用氨基酸分析儀測定南豐蜜桔汁發(fā)酵前后氨基酸的種類及含量。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 20.0軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異比較(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵過程中總酸度、pH和菌落數(shù)的變化

總酸度和pH是發(fā)酵過程中極為重要的參數(shù),直接影響著微生物的生長及代謝產(chǎn)物的生成[22],而且在一定程度上間接的反映發(fā)酵液微生物的生長代謝情況。因此,在乳酸菌發(fā)酵南豐蜜桔汁中,考查總酸度、pH和菌落數(shù)隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律,對于了解發(fā)酵過程中微生物的生長代謝、判斷桔汁發(fā)酵程度具有指導(dǎo)意義。

由圖1(a)可知,在0～2 h左右,是乳酸菌的延滯期,活菌數(shù)略有減少,但是3 h以后乳酸菌快速增長進(jìn)入對數(shù)期,在發(fā)酵10 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期,活菌數(shù)為3.3×109CFU/mL。在發(fā)酵48 h左右,乳酸菌進(jìn)入衰亡期,60 h以后活菌數(shù)仍然保持在2×109CFU/mL,故乳酸菌能夠較好的適應(yīng)桔汁發(fā)酵環(huán)境,發(fā)酵結(jié)束后存活率仍在67%以上。

由圖1(b)可知,總酸度含量整體呈上升趨勢。在0～6 h的發(fā)酵期間,總酸度變化不明顯,6 h以后,總酸度呈現(xiàn)先快速上升后緩慢的增加直至48 h后穩(wěn)定不變的趨勢,發(fā)酵結(jié)束后總酸度為15.64 g/kg,較發(fā)酵前總酸度提高6倍。可能總酸度的變化與乳酸菌生長特性有關(guān):發(fā)酵前期乳酸菌處于遲滯期,此時乳酸菌并不產(chǎn)酸,進(jìn)入對數(shù)期后,乳酸菌利用糖類生長繁殖并產(chǎn)生乳酸等代謝產(chǎn)物;有機(jī)酸的產(chǎn)生使桔汁酸度升高[23],隨著發(fā)酵的進(jìn)行,桔汁中積累大量有機(jī)酸,導(dǎo)致環(huán)境中pH下降,高濃度的酸性環(huán)境和H+會抑制乳酸菌生長與代謝,進(jìn)而使菌的產(chǎn)酸能力受到影響,發(fā)酵后期酸度變化不明顯。

圖1 發(fā)酵過程中菌落數(shù)、總酸度和pH隨發(fā)酵時間的變化Fig.1 Variation of colony forming unit and total acidity and pH value during the fermentation process

pH在發(fā)酵期間呈現(xiàn)下降趨勢,在6～12 h迅速下降,此階段pH的快速下降主要是因?yàn)槿樗峋目焖僭鲋诚奶谴x產(chǎn)酸。另一方面,由于桔汁開始時的介質(zhì)緩沖能力較低,所以發(fā)酵初期產(chǎn)生的少量乳酸也能導(dǎo)致其pH下降顯著。在36 h時,pH下降到3.2,36 h后穩(wěn)定不變。綜上所述,可以看出乳酸菌適應(yīng)強(qiáng)酸環(huán)境發(fā)酵桔汁飲料,本實(shí)驗(yàn)與Darko Dimitrovski等關(guān)于植物乳桿菌PCS26發(fā)酵菊芋功能飲料的研究相符[24]。

對比pH的變化,可以看出發(fā)酵桔汁中總酸度呈現(xiàn)增加的趨勢,發(fā)酵36～48 h期間,pH幾乎穩(wěn)定不變,而總酸度仍在緩慢增加。這是由于pH的大小不僅取決于有機(jī)酸的種類與數(shù)量,而且受桔汁中緩沖物質(zhì)總量及其緩沖能力的影響[22],因此,pH與其總酸度之間并沒有嚴(yán)格的比例關(guān)系。

2.2 南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵過程中糖類物質(zhì)含量的變化

圖2為上述3種底物在桔汁發(fā)酵過程中的變化趨勢。葡萄糖、果糖和蔗糖是蜜桔汁發(fā)酵體系中的主要碳源,初始含量分別為20.97、22.36、42.88 mg/g,主要來源于添加的果葡糖漿和桔汁中本身含有的少量糖類。隨著發(fā)酵進(jìn)行,果糖、葡萄糖、蔗糖含量都呈現(xiàn)下降趨勢,發(fā)酵6 h之后,乳酸菌直接利用果糖和葡萄糖或者本身具有蔗糖水解酶分解蔗糖產(chǎn)生的果糖和葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵[25],使得發(fā)酵桔汁中果糖、葡萄糖、蔗糖含量快速下降。發(fā)酵40 h之后,三者含量的變化緩慢,是因?yàn)樵诎l(fā)酵后期,發(fā)酵桔汁中的環(huán)境因素(如高濃度酸,低pH)在一定程度上對乳酸菌有抑制作用,乳酸菌的代謝活動減慢,三糖的利用率逐漸下降[26]。發(fā)酵結(jié)束后,總糖濃度減少了11.03 mg/g,減少的糖類物質(zhì)用于菌的生長以及在發(fā)酵代謝中轉(zhuǎn)化成其他的有機(jī)酸等營養(yǎng)物質(zhì)。

圖2 發(fā)酵過程中糖類濃度的變化Fig.2 Changes in glucide concentrations during the fermentation

2.3 南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化

對不同發(fā)酵時間桔汁發(fā)酵液取樣測定有機(jī)酸含量變化,得到發(fā)酵液中各有機(jī)酸含量變化見圖3。

圖3 蜜桔發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的變化Fig.3 Changes of organic acids during the fermentation process of Nan Feng orange

酸是發(fā)酵果蔬汁中重要的一種味感,是衡量果汁發(fā)酵質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)之一,有機(jī)酸除來自蜜桔原料以外,還在乳酸菌發(fā)酵蜜桔的代謝過程中產(chǎn)生。從圖3可以看出在蜜桔發(fā)酵前,檸檬酸、蘋果酸、乙酸含量最高,分別為8.6、4.2、3.9 mg/g,是蜜桔的主要有機(jī)酸,此外還檢測到草酸和乳酸,但是含量較少。乳酸在整個發(fā)酵期間呈現(xiàn)一直增加趨勢,由最初濃度0.44 mg/g到發(fā)酵結(jié)束后濃度13.05 mg/g,含量增加了28倍(p<0.05),這是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中,乳酸菌利用葡萄糖,經(jīng)同型發(fā)酵中的糖酵解過程,產(chǎn)生了大量的乳酸[27]。

乙酸可能作為乳酸菌的代謝底物被消耗,在發(fā)酵中期消失(p<0.05)。發(fā)酵后,蘋果酸含量下降到3.69 mg/g,減少了近30.3%(p<0.05),這是因?yàn)樘O果酸可以作為乳酸菌的代謝底物,在蘋果酸脫酸酶的催化下,轉(zhuǎn)化成了部分乳酸[29]。檸檬酸是蜜桔中的主要有機(jī)酸,檸檬酸含量下降到6.5 mg/g,減少了近22.4%(p<0.05),可能是在發(fā)酵過程中,部分檸檬酸作為乳酸菌菌體的營養(yǎng)成分和轉(zhuǎn)化成其他代謝產(chǎn)物[28],而草酸含量在整個發(fā)酵過程中并沒有顯著性變化(p>0.05)。

在發(fā)酵結(jié)束時有機(jī)酸總含量提高了5.5 mg/g,較發(fā)酵前顯著提高。乙酸、乳酸是乳酸菌發(fā)酵果汁產(chǎn)生的短鏈脂肪酸[29-30],短鏈脂肪酸含量由發(fā)酵前的5.23 mg/g增加到發(fā)酵后的13.05 mg/g,其中乳酸酸味柔和醇厚,是發(fā)酵后桔汁中主要的短鏈脂肪酸。有機(jī)酸對蜜桔發(fā)酵過程中的乳酸菌有抑制作用對原漿的風(fēng)味有重要影響,正是不同有機(jī)酸在發(fā)酵果蔬汁的風(fēng)味形成中既發(fā)揮各自獨(dú)特的作用,又會相互協(xié)調(diào)[31],形成了發(fā)酵蜜桔汁獨(dú)特的發(fā)酵風(fēng)味。

2.4 南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵過程中主要抗氧化物質(zhì)含量的變化

人體的衰老效應(yīng)和多種疾病與體內(nèi)自由基有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明食物中尤其是水果和蔬菜中含有的多酚、黃酮、維生素等物質(zhì)具有抗氧化性,可清除體內(nèi)有害自由基,延緩衰老進(jìn)程,預(yù)防各種慢性疾病的發(fā)生[32-33]。

發(fā)酵前后維生素C、總黃酮和多酚的含量測定結(jié)果見表1。由表1可知,經(jīng)乳酸菌代謝產(chǎn)生的低pH環(huán)境具有保護(hù)維生素C不被氧化、分解的作用[34],蜜桔經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,維生素C的含量減少,但仍保持在80%以上,可能是部分維生素C作為代謝底物被乳酸菌在發(fā)酵中利用,產(chǎn)生有機(jī)酸和轉(zhuǎn)化其他維生素,果汁中具有抑菌作用的多酚類物質(zhì)[35]和蛋白質(zhì)反應(yīng)生成大分子聚合物[36],而總黃酮和多酚物質(zhì)含量卻在發(fā)酵后顯著性增加(p<0.05)。一方面乳酸菌在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生某些酯酶水解一些結(jié)合酚,釋放果蔬中的游離酚。另一方面,發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸,也會防止酚類物質(zhì)的降解[37],此外,乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生一些酚酸脫羧酶,能使酚類物質(zhì)之間實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化,可能把復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)[38-39]。

表1 蜜桔飲料發(fā)酵前后成分變化Table 1 Changes of components of Nan Feng orange before and after fermentation

2.5 南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵前后游離氨基酸含量的變化

利用氨基酸分析儀測定南豐蜜桔汁發(fā)酵前后氨基酸的種類及含量,結(jié)果見表2,由表中可知,發(fā)酵前南豐蜜桔漿中共檢測出17種氨基酸,總量為2.28 mg/g,其中必需氨基酸有7種,分別是纈氨酸(0.019 mg/g)、賴氨酸(0.046 mg/g)、異亮氨酸(0.009 mg/g)、亮氨酸(0.013 mg/g)、蛋氨酸(0.004 mg/g)蘇氨酸(0.038 mg/g)和苯丙氨酸(0.053 mg/g),占游離氨基酸的7.9%。蛋氨酸和半胱氨酸為南豐蜜桔中的限制性氨基酸。發(fā)酵后游離氨基酸總量為1.961 mg/g,較發(fā)酵前顯著減少(p<0.05),其中異亮氨酸、酪氨酸在發(fā)酵后未被檢出,天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸含量顯著性減少(p<0.05),在發(fā)酵后期含量下降可能是因?yàn)槲⑸锏拇罅糠敝忱贸潭葟?qiáng)于相關(guān)蛋白質(zhì)的水解強(qiáng)度以及這些氨基酸在發(fā)酵過程下發(fā)生了氧化和轉(zhuǎn)化[40],也可能被乳酸菌代謝利用合成其他揮發(fā)性芳香物質(zhì);半胱氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸在發(fā)酵后含量均有所增加,可能是發(fā)酵后期乳酸菌死亡,菌體蛋白降解導(dǎo)致[41],丙氨酸為南豐蜜桔發(fā)酵后的限制性氨基酸。

表2 南豐蜜桔汁發(fā)酵前后氨基酸變化Table 2 Changes of amino acid of Nan Feng orange before and after fermentation

參照YLVA A等[41-43]的分類方法,根據(jù)呈味不同,氨基酸可以分為甜味氨基酸(Ala、His、Pro、Ser、Thr、Gly)、鮮味氨基酸(Glu、Lys、Asp)、苦味氨基酸(Arg、Ile、Leu、Val、Trp、Met)、酸味氨基酸(Asp、Gly)和芳香味氨基酸(Tyr、Cys、Phe)。由圖4可知,南豐蜜桔發(fā)酵后呈味氨基酸組成發(fā)生變化,鮮味氨基酸由0.251 mg/g減少到0.09 mg/g,苦味氨基酸由1.095 mg/g減少到0.891 mg/g,減少了18.6%,酸味氨基酸含量由0.167 mg/g增加到0.27 mg/g,甜味氨基酸含量由0.862 mg/g減少到0.682 mg/g,芳香味氨基酸含量由0.074 mg/g減少到0.012 mg/g。南豐蜜桔的口感是由氨基酸與糖類、酸類、酯類等其他呈味物質(zhì)共同作用產(chǎn)生的,發(fā)酵后酸味氨基酸含量增多,加之苦味氨基酸含量顯著性減少(p<0.05),一定程度改善了南豐蜜桔的口感。

圖4 南豐蜜桔汁發(fā)酵前后呈味氨基酸的變化Fig.4 Changes of flavor amino acids of Nan Feng orange before and after fermentation 注：不同字母表示發(fā)酵前發(fā)酵后 氨基酸含量差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論

乳酸菌能夠較好的適應(yīng)南豐蜜桔汁發(fā)酵環(huán)境,發(fā)酵3 h左右,乳酸菌進(jìn)入對數(shù)期,10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期,60 h以后活菌量仍然在2×109CFU/mL,發(fā)酵結(jié)束后pH下降至3.2左右,總酸度顯著性提高了近6倍(p<0.05)。乳酸菌發(fā)酵對草酸含量沒有顯著影響(p>0.05),檸檬酸、蘋果酸、乙酸含量呈下降趨勢,特別是乙酸在發(fā)酵中期消失,乳酸顯著性增加(p<0.05),質(zhì)量濃度由0.44 mg/g增加至13.05 mg/g。短鏈脂肪酸由發(fā)酵前的5.23 mg/g增加到13.05 mg/g,大大提高了蜜桔的保健功能。南豐蜜桔汁發(fā)酵前后,維生素C含量顯著性減少(p<0.05),總黃酮和多酚類化合物含量顯著性增加了12.9%和8%(p<0.05)。發(fā)酵后氨基酸總量減少了13.9%,呈味氨基酸組成發(fā)生變化。乳酸菌可以作為發(fā)酵型南豐蜜桔汁的發(fā)酵劑,南豐蜜桔汁乳酸菌發(fā)酵可以提高其營養(yǎng)保健價值,改善風(fēng)味。

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