湖泊水體營養狀態對沉積物好氧氨氧化菌異質性的影響

孫 旭，胡志新，楊柳燕

(1.南京大學環境學院，江蘇 南京 210023; 2.污染控制與資源化國家重點實驗室，江蘇 南京 210023;3.環境保護部南京環境科學研究所，江蘇 南京 210042; 4.南京工程學院環境工程學院，江蘇 南京 211167)

與反硝化耦合的硝化作用在湖泊氮循環中起著重要作用。氨氧化過程是硝化過程的限速步驟，氨氧化細菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)是氨氧化過程的驅動者，但是隨著對氨單加氧酶α亞基基因作為分子生物標記物研究的深入，發現在好氧氨氧化過程中還存在另一類原核微生物——氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)[1-2]。研究表明，在土壤、河口、海洋、淡水沉積物中均發現AOA的蹤跡，且數量遠超過AOB。在寡營養和極端環境中，AOA是好氧氨氧化過程的主要驅動者[3-4]。

AOA和AOB在不同生境的分化除了自身進化的差異外，環境因子如氨濃度、DO、pH等也是其分布的主要調控因素[5-7]，另外，湖泊水體的營養狀況也是影響沉積物氨氧化微生物分布和功能的一個潛在因素。研究表明，隨著湖泊富營養化程度的加重，沉積物中AOA和AOB的多樣性增加，且富營養狀態湖泊沉積物中AOB的豐度和多樣性都遠遠高于貧營養狀態湖泊[8-11]，但是也有研究表明，不同湖區沉積物中氨氧化微生物的豐度和多樣性與湖泊營養狀態無關[12-13]。本課題組前期研究發現，不同生態類型湖泊沉積物中AOA和AOB群落組成并無顯著差異，而沉積物中有機質含量是影響AOA和AOB異質性分布的主要因子[14-15]，湖泊生態類型與富營養化程度有時會存在不一致的現象，因此湖泊富營養化狀態與湖泊沉積物好氧氨氧化菌組成的關系還存在爭議[12,16]。鑒于湖泊生態系統的復雜性以及營養狀態劃定的差異，有必要對不同營養狀況下好氧氨氧化菌的異質性進行深入研究。

本研究以江蘇省7個湖泊為研究對象，利用分子生物學的方法，對不同營養狀態湖泊沉積物中氨氧化菌的群落結構進行分析，目的在于了解不同營養狀況下湖泊沉積物氨氧化菌的群落特征，同時探索其潛在的調控因子，為富營養化湖泊氮素控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

以江蘇省洪澤湖(HZ)、白馬湖(BM)、高郵湖(GY)、玄武湖(XW)、石臼湖(SJ)、固城湖(GC)和太湖(T)7個湖泊為研究對象，具體采樣點位置見圖1。于2012年4月，用采水器采集距水面0.5 m處的上覆水，低溫保存在1 L的聚乙烯瓶內，帶回實驗室立即測定葉綠素a(Chl-a)及其他常規理化指標。采用彼得森采集器采集湖泊沉積物樣品，取表層5 cm樣品混勻后放入無菌的聚乙烯自封袋，低溫保存運回實驗室，保存在-80℃低溫冰箱中備用。

圖1 湖泊采樣點位置

1.2 水質常規理化指標分析

1.3 沉積物AOA和AOB豐度及群落結構分析

按照土壤DNA試劑盒(MoBio Laboratories, Carlsbad, USA)的操作說明提取沉積物基因組DNA，用50 μL無菌水洗脫后，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證及230、260、280 nm吸光值測定檢驗提取效率和純度，用NanoDrop?2000分光光度計(NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE) 測定待測DNA樣品的濃度。采用引物AF/AR和1F/2R分別擴增AOA和AOB的amoA基因，其拷貝數采用熒光定量PCR方法(Bio-Rad CFX96 real-time System)進行分析，使用一系列10倍稀釋的質粒制備標準曲線，AOA的amoA基因拷貝數從1.0×101μL-1到1.0 ×106μL-1，擴增效率為91.8%(R2=1.00)；AOB的amoA基因拷貝數在1.0×102μL-1到1.0×107μL-1之間，擴增效率為90.2% (R2=0.99)。Ct值(threshold cycle)和數據分析通過iCycler software (version 1.0.1384.0 CR)完成[19]。采用CEQ 8000 Genetic Analyzer (Beckman CEQ8000)遺傳分析儀分別用限制性內切酶MspⅠ和Hpy8Ⅰ對AOB和AOA的amoA基因進行限制性片段長度多態性(terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析[15]。

1.4 數據分析

湖泊營養狀態采用綜合營養狀態指數(trophic status index, ITSI)法進行評價，評價指標參數包括Chl-a、TN、TP、CODMn和透明度共5項[20]。

以T-RFLP圖譜中每一個限制性片段(T-RF)為一個可操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)，OTU豐度按照Saikaly的方法計算，即以相對峰高值(每個T-RF的峰高除以累計峰高值，舍去小于2%的值)作為OTU豐度，峰高值低于200熒光單位的峰不予考慮。根據圖譜中OTU的數目及其豐度用BIODAP程序進行Shannon-Wiener多樣性指數計算。

采用SPSS 18.0軟件進行數據方差和相關性分析，采用Canoco 4.5軟件分析AOA和AOB的T-RFLP指紋圖譜，確定其群落結構，所有的環境因子和每個T-RF的相對峰值都進行lg(x+1)轉化，分別構成環境矩陣和物種矩陣，進行典范對應分析(canonical correspondence analysis, CCA)。

2 結果與分析

2.1 湖泊富營養化狀態

如圖2所示，根據水體綜合營養狀態指數ITSI，7個湖泊共計23個研究湖區的營養狀態可分為兩個等級，14個湖區處于中營養狀態(30

圖 2 不同湖泊不同湖區水體綜合營養狀態指數

2.2 湖泊水體營養狀態對沉積物好氧氨氧化菌豐度的影響

采用熒光定量PCR方法分析湖泊沉積物AOA和AOB的豐度，結果見圖3。隨著湖泊營養狀態的提升，沉積物AOA和AOB的豐度也有所增加，每克底泥AOA的amoA基因拷貝數從中營養狀態的3.91×106增加到輕度富營養狀態的1.30×107(P=0.06，T-test)，AOB的amoA基因拷貝數從3.82×106增加到6.07×106(P=0.372，T-test)。同一營養化狀態的湖泊沉積物AOA的豐度高于AOB的豐度，但二者之間并無顯著差異。

圖3 不同營養狀態湖區AOA和AOB豐度箱線圖(相同字母表示P>0.05)

2.3 湖泊水體營養狀態對沉積物好氧氨氧化菌群落組成的影響

(a) AOA(b) AOB圖4 湖泊沉積物中AOA和AOB amoA基因的T-RFLP指紋圖譜

如圖4所示，湖泊水體營養狀態對AOA和AOB的優勢種屬并未產生影響。用限制性內切酶MspⅠ酶切得到AOA 6個主要片段T-RF56、T-RF74、T-RF90、T-RF94、T-RF99、T-RF434，優勢片段T-RF 56和T-RF 74在中營養和輕度富營養湖泊沉積物均有檢出；而片段T-RF90、T-RF94和T-RF99主要出現在中營養湖泊沉積物中，T-RF434出現在輕度富營養湖泊沉積物中。用限制性內切酶Hpy8Ⅰ酶切得到AOB 2個較高相對豐度的片段(T-RF60和T-RF155)，其在不同營養狀態湖泊沉積物均有檢出；其他片段僅出現在1～3個湖區。

不同湖泊湖區沉積物中AOA和AOB群落多樣性變化情況見圖5。從圖5可以看出，AOA群落Shannon-Wiener指數從中營養化湖泊的1.57下降到輕度富營養湖泊的1.39，AOB群落Shannon-Wiener指數從0.28上升到0.32，但是，湖泊水體營養狀態對沉積物好氧氨氧化微生物群落多樣性影響無顯著性差異，然而在同一營養狀態下，沉積物中AOA群落的多樣性顯著高于AOB群落。

圖5 不同營養狀態湖區沉積物AOA和AOB群落Shannon-Wiener指數箱線圖

2.4 上覆水理化性質對沉積物氨氧化菌群落結構的影響

表1 AOA和AOB豐度和多樣性與上覆水水質的相關性分析結果

注： *表示P<0.05;**表示P<0.01。

(a) AOA

(b) AOB圖6 湖泊上覆水理化性質與沉積物氨氧化菌的CCA分析

3 討 論

4 結 論

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