不同劑型和負(fù)荷劑量西羅莫司的毒性作用分析

孔祥瑞，李 靜，周 林，肖 漓，石炳毅

西羅莫司(SRL)具有免疫抑制、抗腫瘤、抗真菌的多重作用，被廣泛應(yīng)用于實(shí)體器官移植[1-2]，尤其是對(duì)惡性腫瘤受者，雖取得較好的臨床療效，但卻常因黏膜潰瘍、高膽固醇和甘油三酯血癥、高血壓以及由于骨髓抑制增加感染和淋巴瘤的風(fēng)險(xiǎn)，使其應(yīng)用受到限制[3]。近年來(lái)，雖然發(fā)現(xiàn)SRL治療可引起嚴(yán)重的骨髓抑制、血小板減少以及肺炎，但仍有較多的研究證實(shí)肝移植后肝癌患者轉(zhuǎn)換mTORi免疫抑制方案有助于腫瘤復(fù)發(fā)的防治[4-5]。本研究在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同藥物劑型、劑量和給藥方式的不良反應(yīng)差異明顯，且對(duì)大鼠的生存有較大影響，對(duì)SRL在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用及臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，體重200～220 g，均購(gòu)于解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證：SCXK-(軍)2012-004。

1.1.2試驗(yàn)試劑：西羅莫司片劑(美國(guó)惠氏制藥有限公司)由海正輝瑞制藥有限公司惠贈(zèng)，西羅莫司口服液由杭州中美華東制藥有限公司惠贈(zèng)，緩釋劑牛膠原蛋白活性肽由北京紫霞環(huán)保生物工程技術(shù)有限公司資助。

1.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組：SD雄性大鼠60只隨機(jī)分為A1組、A2組、A3組、B1組、B2組、B3組，每組10只。

1.2.2實(shí)驗(yàn)干預(yù)：A1組給予SRL高劑量片劑普通灌胃、A2組給予SRL高劑量片劑緩釋灌胃、A3組給予SRL低劑量片劑緩釋灌胃、B1組給予SRL高劑量口服液普通灌胃、B2組給予SRL高劑量口服液緩釋灌胃、B3組給予SRL低劑量口服液緩釋灌胃。A1、A2、B1、B2組負(fù)荷劑量1 mg/kg，1/d；A3、B3組負(fù)荷劑量0.5 mg/kg，1/d。除A1、B1組外其余各組藥物均進(jìn)行緩釋處理；實(shí)驗(yàn)持續(xù)30 d。

1.2.3緩釋方案：西羅莫司片劑搗碎粉末狀，以注射用滅菌用水溶解，牛膠原蛋白活性肽溶于水溶液，終濃度為5%；西羅莫司口服液緩釋劑用牛膠原蛋白活性肽直接溶于稀釋后的西羅莫司口服液，終濃度為5%。

1.3觀察指標(biāo)及方法 記錄各組大鼠的飲食情況和體重變化；詳細(xì)記錄各組大鼠的器官病變情況、死亡率以及生存時(shí)間。對(duì)死亡大鼠解剖，標(biāo)本固定，拍照；試驗(yàn)結(jié)束后所有存活大鼠，均麻醉狀態(tài)下處死，取材，標(biāo)本固定，拍照。器官病變情況主要觀察肝臟色澤輕度為顏色略變深，重度為顏色深暗、發(fā)黑；肺臟結(jié)節(jié)病變輕度為結(jié)節(jié)<5個(gè)，中度為5～10個(gè)，重度為>10個(gè)；胃潰瘍輕度為侵犯黏膜層，中度為侵犯黏膜下層至肌層，重度為侵犯肌層及漿膜層、胃呈透明薄膜狀。

2 結(jié)果

2.1一般情況及死亡率 藥物干預(yù)后第3天開(kāi)始，所有實(shí)驗(yàn)組大鼠食欲有不同程度降低，以A1和B1組最為明顯，A2和B2組次之，A3和B3組變化最小，隨著實(shí)驗(yàn)持續(xù)，各組大鼠飲食狀況逐漸好轉(zhuǎn)。定期監(jiān)測(cè)所有大鼠體重，直至實(shí)驗(yàn)終止，各組體重變化情況，見(jiàn)表1。第30天，A1、A2、A3組間體重比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.566，P=0.002)；B1、B2、B3組間體重比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.481，P<0.001)。第30天，A1組與B1組、A2組與B2組、A3組與B3組體重比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.736、-0.674、-1.927，P=0.100、0.509、0.070)。從第5天開(kāi)始，實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)死亡；至第30天時(shí)，A1、A2、A3、B1、B2、B3組分別死亡10只(100%)、6只(60%)、1只(10%)、8只(80%)、3只(30%)、0只。A1組死亡率高于A2組(χ2=5.000，P=0.025)，A2組死亡率高于A3組(χ2=5.494，P=0.019)。B1組死亡率顯著高于B2組(χ2=5.051，P=0.025)，但B2組與B3組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.529，P=0.06)。A1組與B1組、A2組與B2組、A3組與B3組死亡率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.222、1.818、1.053，P=0.136、0.074、0.136)。

2.2器官病變情況 對(duì)各組大鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，在負(fù)荷劑量、劑型不同的情況下，各組大鼠肝、肺、胃、腎、小腸等臟器出現(xiàn)輕重不同的病變；且與高負(fù)荷劑量組相比，低負(fù)荷劑量組大鼠肝、肺、胃臟器的病變明顯減少，病變程度輕。見(jiàn)表2。

2.3生存時(shí)間比較 各組最短生存時(shí)間為5 d，最長(zhǎng)生存時(shí)間30 d(至實(shí)驗(yàn)終止時(shí))。對(duì)各組生存時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier分析，采用log-rank法進(jìn)行比較，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，低負(fù)荷劑量組具有良好生存效益，生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

表1 6組大鼠各實(shí)驗(yàn)階段的體重變化情況

注：A1組西羅莫司片劑普通灌胃，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃，B1組西羅莫司口服液普通灌胃，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃；第30天A1、A2、A3組間比較，F(xiàn)=7.566，P=0.002；第30天B1、B2、B3組間比較，F(xiàn)=25.481，P<0.001

表2 6組大鼠的器官病變情況(只)

注：A1組西羅莫司片劑普通灌胃，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃，B1組西羅莫司口服液普通灌胃，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃

圖16組大鼠的生存時(shí)間比較

A1組西羅莫司片劑普通灌胃(1 mg/kg)，A2組西羅莫司片劑緩釋灌胃(1 mg/kg)，A3組西羅莫司片劑緩釋灌胃(0.5 mg/kg)，B1組西羅莫司口服液普通灌胃(1 mg/kg)，B2組西羅莫司口服液緩釋灌胃(1 mg/kg)，B3組西羅莫司口服液緩釋灌胃(0.5 mg/kg)

3 討論

SRL又稱雷帕霉素于1999年開(kāi)始用于治療器官移植排斥反應(yīng)，與普樂(lè)可復(fù)(FK506)的結(jié)構(gòu)相似，但免疫抑制機(jī)制卻截然不同，F(xiàn)K506抑制T淋巴細(xì)胞由G0期至G1期的增殖[6]；而SRL則通過(guò)不同的細(xì)胞因子受體阻斷信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷T淋巴細(xì)胞及其他細(xì)胞由G1期至S期的進(jìn)程。與FK506相比，SRL可阻斷T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的鈣依賴性和非鈣依賴性信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)[7]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用表明，SRL是一種免疫抑制作用良好，毒性較低，基本無(wú)腎毒性的新型免疫抑制劑[8]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，SRL治療可引起高脂血癥、嚴(yán)重的骨髓抑制、血小板減少以及肺炎等不良反應(yīng)[9]。然而有越來(lái)越多的研究表明，在器官移植后SRL替代鈣調(diào)磷酸酶抑制劑類(lèi)藥物可以明顯減少這類(lèi)藥物的腎毒性和神經(jīng)毒性[10-12]，尤其有助于惡性腫瘤患者移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的防治。近年來(lái)的研究結(jié)果顯示，SRL在保護(hù)移植物的同時(shí)還可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)[13]。

有研究在以SRL為基礎(chǔ)方案的預(yù)防肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，因服藥方式的不同，部分患者出現(xiàn)難治性黏膜潰瘍(口腔潰瘍、胃潰瘍)，在單用SRL超劑量時(shí)部分患者會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重間質(zhì)性肺炎、骨髓抑制及血小板降低等[5]。在早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，SRL負(fù)荷劑量以文獻(xiàn)報(bào)道的1 mg/kg為標(biāo)準(zhǔn)干預(yù)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藥物毒性作用明顯，尤其黏膜潰瘍及難治性肺炎，多數(shù)研究對(duì)象在短期內(nèi)出現(xiàn)明顯體重減輕及死亡。本研究是基于以上問(wèn)題而設(shè)計(jì)，旨在探索合適的負(fù)荷劑量及干預(yù)方式，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供合適的藥物劑量參考。

本研究發(fā)現(xiàn)，在高負(fù)荷劑量(1 mg/kg)及干預(yù)方式相同情況下(A1組與B1組、A2組與B2組)，雖然SRL片劑與口服液毒性作用無(wú)明顯組間差異，但二者所產(chǎn)生的毒性作用嚴(yán)重且致死率較高，說(shuō)明在高負(fù)荷劑量時(shí)，無(wú)論采取何種干預(yù)方式，片劑和口服液均有較大的毒性作用。然而對(duì)同一劑型在負(fù)荷劑量相同情況下采用不同干預(yù)方式發(fā)現(xiàn)(A1組與A2組；B1組與B2組)，雖然藥物毒性作用依然顯著，半數(shù)致死量大，但組內(nèi)差異顯著，提示藥物緩釋技術(shù)有助于減輕SRL嚴(yán)重毒性作用。低負(fù)荷劑量(0.5 mg/kg)干預(yù)時(shí)，不同劑型組間死亡率和生存時(shí)間比較，差異無(wú)顯著性意義，與高負(fù)荷劑量相比，不同劑型組內(nèi)差異顯著。此外本研究還發(fā)現(xiàn)，低負(fù)荷劑量緩釋SRL藥物干預(yù)對(duì)大鼠體重增加、生存時(shí)間延長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。

既往文獻(xiàn)報(bào)道，SRL干預(yù)劑量為1 mg/kg時(shí)，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證毒副作用明顯，且耐受性差[14]。本研究認(rèn)為雖然劑型不同，但低負(fù)荷劑量緩釋SRL耐受性良好，毒性作用小，與高負(fù)荷劑量SRL干預(yù)相比，具有良好的生存效益，因而建議在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中采用低負(fù)荷劑量緩釋SRL的干預(yù)方式，以減輕因劑量及給藥不同所產(chǎn)生的毒性作用。

本研究結(jié)果顯示，在動(dòng)物基礎(chǔ)藥效研究中，SRL口服液比片劑更容易使用，緩釋藥液容易制備，且濃度均一，并可節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。臨床治療中，雖然沒(méi)有明確的界定，但因片劑的方便性，目前廣泛應(yīng)用，在藥物口服過(guò)程中，包裹緩釋空膠囊是較好的選擇，并可能實(shí)現(xiàn)藥效持續(xù)釋放。至于緩釋技術(shù)是否能提高藥物的吸收及藥效，還需要進(jìn)一步研究進(jìn)行證實(shí)。本研究受樣本量和實(shí)驗(yàn)時(shí)間影響具有一定的局限性，需要更大樣本量、長(zhǎng)時(shí)間隨訪結(jié)果來(lái)進(jìn)一步證實(shí)低負(fù)荷劑量緩釋SRL干預(yù)的效益，亦需要相關(guān)臨床研究證實(shí)緩釋技術(shù)對(duì)藥效的影響。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Zuckermann A, Eisen H, See T S,etal. Sirolimus conversion after heart transplant: risk factors for acute rejection and predictors of renal function response[J].Am J Transplant, 2014,14(9):2048-2054.

[2] White M, Boucher A, Dandavino R,etal. Sirolimus immunoprophylaxis and renal histological changes in long-term cardiac transplant recipients: a pilot study[J].Ann Pharmacother, 2014,48(7):837-846.

[3] 安玉玲,張婷婷,蔡常潔.西羅莫司用于治療肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)患者的療效分析[J].器官移植,2011,2(2):73-76.

[4] 潘明杰,杜蓉,陳鷹,等.西羅莫司新劑型的研究概述[J].中國(guó)藥師,2016,19(6):1183-1186.

[5] 周林,鄭永根,杜國(guó)盛,等.肝癌肝移植術(shù)后西羅莫司轉(zhuǎn)換治療的免疫學(xué)效應(yīng)分析[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2017,29(4):24-28.

[6] 李立新,賀強(qiáng),陳大志,等.肝癌肝移植術(shù)后雷帕霉素與普樂(lè)可復(fù)為主免疫抑制治療結(jié)果初探[J].中華肝膽外科雜志,2008,14(6):368-370.

[7] 霍文.腎移植后西羅莫司致不良反應(yīng)的文獻(xiàn)分析[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2010,14(31):5825-5828.

[8] 馬田甜,王彥娥,李馥伶,等.腎移植術(shù)后免疫抑制治療方案的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥與臨床雜志,2016,35(9):603-610.

[9] 薛孟娟,呂朝陽(yáng),張堯,等.抗器官排斥藥物和方案對(duì)器官移植術(shù)后血脂變化的影響[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2015,31(9):816-818.

[10] 陳小娟,黃曉寧,李勇.西羅莫司對(duì)比他克莫司用于腎移植后抗排異療效和安全性的Meta分析[J].中國(guó)藥房,2016,27(27):3821-3824.

[11] 劉力瑋,何金丹,王曉碩,等.腎移植術(shù)后應(yīng)用他克莫司與西羅莫司為初始免疫抑制劑的薈萃分析[J].中華器官移植雜志,2015,36(12):741-747.

[12] Sereno J, Vala H, Nunes S,etal. Cyclosporine A-induced nephrotoxicity is ameliorated by dose reduction and conversion to sirolimus in the rat[J].J Physiol Pharmacol, 2015,66(2):285-299.

[13] 俞能旺,郝俊文,劉貞,等.腎移植術(shù)后并發(fā)惡性腫瘤患者應(yīng)用西羅莫司的經(jīng)驗(yàn)[J].中華器官移植雜志,2015,36(6):373-374.

[14] 蔡蕤,王軍,張新樂(lè).西羅莫司不同血藥濃度對(duì)腎移植患者肝腎功能的影響[J].中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥,2016,11(4):124-125.