刺猬紫檀木材DNA條形碼鑒定研究

鄧格求　呂葉香　余鴻發　徐峰

摘 要：該文以采自不同產地的刺猬紫檀木材為研究對象，提取并擴增核ITS2、葉綠體matK基因及葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32，采用BLAST和NJ樹法評價不同DNA條形碼候選序列的鑒定能力。結果表明，ITS2序列具有最高的擴增和測序效率，ITS2序列的平均種間遺傳距離也明顯高于種內遺傳距離。ITS2序列可以將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區分開來。

關鍵詞：刺猬紫檀；DNA條形碼；木材識別

中圖分類號 S781 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）05-0023-03

刺猬紫檀（Pterocarpuserinaceus Poir.）為豆科紫檀屬大喬木樹種，主要分布于西非國家，是我國紅木標準（GB/T18107-2000）中5屬8類33種紅木樹種之一。刺猬紫檀的葉片、樹皮和樹根均具有重要藥用價值，其內含提取物具有治療慢性腹瀉、抗瘧疾和治療腸道寄生蟲感染等功效[1]。刺猬紫檀常被用來制作高檔家具和工藝品，深受消費者喜愛和追捧。這也造成了刺猬紫檀砍伐量的激增，直接導致該樹種野生資源日益枯竭。

傳統的木材識別方法具有一定的局限性，難以將木材樹種準確地識別到種的水平[2]。隨著研究水平和檢測手段的不斷發展和進步，在傳統的木材識別技術的基礎上，其他領域的分析方法開始嘗試應用到木材識別和鑒定中，極大地豐富了木材識別與鑒定的手段[3]。目前，國內采用紅外光譜技術對于刺猬紫檀及其近緣種樹種木材的識別研究較多[4-6]，但采用DNA條形碼技術識別刺猬紫檀木材的研究還未廣泛開展。為此，本研究以采自不同產地的刺猬紫檀木材為研究對象，提取并擴增核ITS2、葉綠體matK基因及葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32，并采用BLAST和NJ樹法評價不同DNA條形碼候選序列的鑒定能力，以期為利用DNA條形碼技術準確地識別刺猬紫檀及其近緣種木材提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究刺猬紫檀木材試樣分別產自非洲西部7個不同的國家，樣品信息和產地來源見表1。所有木材試樣在進行DNA提取前均需用無菌刀片切除木材表面部分，并將木材試樣切成小片置于冷凍研磨儀中低溫制備成粉末后備用。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取及純化 稱取500mg木材粉末置于50mL無菌離心管中，使用DNA提取試劑盒（DNeasy Plant Maxi Kit，QIAGEN）提取木材總DNA。木材DNA純化采用PCR擴增模板純化試劑盒（High Pure PCR Template Preparation Kit，Roche）純化DNA提取物。

1.2.2 DNA條形碼序列的擴增、產物純化及克隆測序 通過比較和分析GenBank已公布的紫檀屬細胞核ITS2、葉綠體matK基因和葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32，設計3對DNA條形碼序列擴增引物。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。3條DNA條形碼序列擴增引物信息和反應體系見表2。PCR產物特異性通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit（全式金）進行膠回收純化回收，純化回收后的DNA條形碼片段克隆采用pEASY-T1 Simple Cloning Kit（全式金），并在固體LB平板中進行培養和藍白斑篩選。將鑒定為陽性克隆重組子的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，為保證測序結果準確性，每個樣品選擇5個獨立的克隆重組子進行雙向測序。

1.2.3 DNA條形碼序列的分析 測序結果采用Lasergene Suite 7軟件進行正反向序列校對和拼接，去除引物兩端載體序列。采用MEGA 5.0軟件的Kimura two parameter（K2P）模型進行DNA條形碼種間和種內遺傳距離計算，統計序列的堿基組成、變異位點和信息位點等序列特征信息。采用BLAST方法對獲得的DNA條形碼序列在GenBank數據庫中進行相似性同源搜索。將GenBank中與刺猬紫檀DNA條形碼序列同源性序列較高的同屬其他種序列（見表3）與本研究獲取的DNA條形碼序列一起采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構建系統發育樹，系統發育樹各分支的置信度用自舉檢驗法（boot-strap text）作1000次可信度分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增和測序成功率 3條DNA條形碼候選序列的PCR擴增和測序成功率結果如圖1所示。由圖1可知，ITS2序列PCR擴增成功率最高為93%，葉綠體基因間隔序列ndhF-rpl32最低為79%。核ITS2序列多拷貝存在于核基因組中，這可為降解為小片段的DNA擴增提供有利的條件和保證[7]。由于在對木材DNA進行PCR擴增反應時，通常會出現非特異性擴增和低豐度擴增PCR擴增條帶，如直接進行測序無法獲得準確的結果或出現測序失敗。為提高測序成功率本研究采用克隆測序的方法，結果顯示3條DNA條形碼候選序列的測序成功率均為100%。

2.2 刺猬紫檀種內及種間變異 通過對7個不同產地刺猬紫檀的3條候選DNA條形碼序列進行多重比對，ITS2序列種內存在2個變異位點，其中168bp位點T顛換為A，196bp位點G轉換為A，且這2個變異位點均來自于馬里的CW021。通過BLAST同源性比對，不同產地的刺猬紫檀木材ITS2序列與GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083478）ITS2序列的最大相似度值為99%。7個不同產地刺猬紫檀的matK和ndhF-rpl32種內均為發現變異位點，且分別與GenBank已公布的刺猬紫檀（JN083542和JN083598）的matK和ndhF-rpl32序列的最大相似度值為98%。對本研究獲得的刺猬紫檀以及GenBank下載的已公布的紫檀屬其他不同種的3種DNA條形碼的種間和種內遺傳距離、堿基組成、變異位點和信息位點進行分析（表4）。結果表明，ITS2序列的GC含量最高為67%，葉綠體基因間隔區ndhF-rpl32序列的GC含量最低為27%。3條候選DNA條形碼中，ITS2序列種間存在最多的變異位點和信息位點。此外，ITS2序列的平均種間遺傳距離也明顯高于種內遺傳距離。

2.3 刺猬紫檀及其同屬近緣種NJ樹聚類分析 本研究選取紫檀屬種間變異較大的ITS2序列構建NJ樹（圖2），結果表明，不同產地的刺猬紫檀首先聚類為一支，bootstrap值支持率為100%，表現出明顯的單系性，其他紫檀屬樹種各自聚類。因此，ITS2序列可以準確地將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區分開來。

3 結論與討論

刺猬紫檀木材ITS2序列擴增和測序成功率最高，種間遺傳距離大于種內遺傳距離，基于ITS2序列構建的系統進化樹能夠成功地將刺猬紫檀木材與其他同屬近緣紫檀屬樹種木材區分開來，但ITS2序列作為DNA條形碼無法將不同產地的刺猬紫檀木材準確區分，對于刺猬紫檀木材產地溯源研究還需進一步深入研究。

參考文獻

[1]Karou D，Dicko M H，Sanon S，et al.Antimalarial activity of Sidaacuta Burm.f.（Malvaceae） and Pterocarpuserinaceus Poir.（Fabaceae）[J].Journal of Ethnopharmacology，2003，89（2）：291-294.

[2]劉金良，伏建國，楊曉軍，等.進口針葉木木材的DNA提取與分子鑒定方法[J].中南林業科技大學學報，2012，32（8）：131-136.

[3]高珊，金鑫，徐小玉，等.木材的DNA鑒定技術綜述[J].刑事技術，2014，39（5）：49-51.

[4]張妍茵，顧玉琦，張雯雅.近紅外光譜技術對紅木家具的鑒別[J].安徽農業科學，2017，45（22）：115-116.

[5]張蓉，徐魁梧，張麗沙，等.基于紅外光譜的5種紅木樹種識別探討[J].林業工程學報，2014，28（2）：95-99.

[6]程士超，李丹，張求慧，等.5種花梨木的紅外光譜比較分析[J].北京林業大學學報，2016，38（1）：118-124.

[7]余敏，張浩，劉盛全，等.降香黃檀木材DNA提取及rDNA-ITS序列條形碼分子鑒定[J].林產化學與工業，2014，34（5）：103-108.

（責編：張宏民）