決明子及炒決明子HPLC化學(xué)指紋特征及6種成分的比較研究

鄒 妍，鄢海燕

（1.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650091；2.皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽蕪湖 241002）

決明子是豆科植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L.的干燥成熟種子，有清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效〔1〕，最初記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》〔2〕。蒽醌類成分是其主要的活性成分，含量較高。大黃素、大黃酚、大黃酸、大黃素甲醚及橙黃決明素等在國(guó)內(nèi)外研究較多，且都有明顯的藥理活性〔3〕。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）對(duì)決明子和炒決明子以稀鹽酸水解后，以大黃酚和橙黃決明素作為決明子及炒決明子化學(xué)質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分〔1〕。僅以一個(gè)或兩個(gè)指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量控制不能全面地反映決明子藥材的內(nèi)在含量，特別是水解處理后決明子及炒決明子中的苷類成分均水解為苷元，無法充分反映決明子及炒決明子的內(nèi)在化學(xué)成分的差異〔4-5〕。為此，本研究采用高效液相色譜法建立12批決明子及炒決明子未水解的化學(xué)指紋圖譜并對(duì)決明子及炒決明子中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚6種成分進(jìn)行定量分析，以期深入研究決明子炒制前后指紋特征、化學(xué)成分的變化，為進(jìn)一步提高決明子炮制工藝及質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（含LC-20A真空在線脫氣機(jī)，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱溫箱，SPD-M20A檢測(cè)器）；FA2004型電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑 橙黃決明素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17032405，含量≥98%），蘆薈大黃素（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：L07-140210，含量≥98%），大黃酸（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：D05-140210，含量≥98%），大黃素（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：17032204，含量≥98%），大黃酚（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：D02-140210，含量≥98%），大黃素甲醚（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)：D04-140210，含量≥98%）。12批決明子的藥材來源見表1。經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄒純才副教授鑒定為豆科植物小決明（Cassia tora L.）的干燥成熟種子。炒決明子為實(shí)驗(yàn)室參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）〔1〕自制，即：取決明子，照清炒法〔6〕炒至微鼓起、有香氣。

表1 藥材來源

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別取橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，以甲醇溶解，配置質(zhì)量濃度分別為96、176、112、168、148、108 μg∕mL的對(duì)照品溶液。

2.1.2 樣品溶液的制備 決明子及炒決明子粉碎，過40目篩，各取1 g，精密稱定，分別加100 mL二氯甲烷回流80 min，所得二氯甲烷層回收溶劑后，分別以甲醇定容于25 mL容量瓶中，得0.04 g∕mL（每mL含原藥材0.04 g）的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（流動(dòng)相A：0～15 min，35%→35%；15～18 min，35%→32%；18～23 min，32%→32%；23～25 min，32%→35%；25～45 min，35%→50%；45～63 min，50%→55%；63～85 min，55%→55%；85～100 min，55%→90%），流速為1.0 mL∕min；柱溫25 ℃；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)287 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.3 相似度計(jì)算 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版本）進(jìn)行多點(diǎn)校正、Mark峰及全譜峰匹配、生成對(duì)照?qǐng)D譜并進(jìn)行相似度計(jì)算。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 決明子及炒決明子指紋特征的研究

3.1.1 決明子及炒決明子指紋圖譜 橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚6種成分的混合對(duì)照品、決明子及炒決明子樣品的色譜圖，見圖1～3。

圖1 混合對(duì)照品的色譜圖

圖2 決明子的HPLC色譜圖

圖3 炒決明子的HPLC色譜圖

3.1.2 決明子及炒決明子共有模式的建立 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版本）對(duì)12批決明子、炒決明子樣品指紋圖譜進(jìn)行多點(diǎn)校正、峰匹配、生成對(duì)照?qǐng)D譜，見圖4～5。

3.1.3 相似度評(píng)價(jià) 采用國(guó)家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012.130723版本），對(duì)圖4～5中的指紋圖譜進(jìn)行處理。設(shè)置S1為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正，分別進(jìn)行全譜峰匹配和Mark峰匹配，生成對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算各樣品與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。見表2。

3.2 決明子及炒決明子6種成分的定量分析

圖4 12批決明子的HPLC指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜

圖5 12批炒決明子的HPLC指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜

表2 相似度計(jì)算結(jié)果（xˉ±s，n=12）

表3 決明子中6種成分的回歸方程

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取對(duì)照品適量，以甲醇為溶劑分別配制系列混合對(duì)照液，并逐步稀釋為5個(gè)系列濃度，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。見表3。3.2.2 方法學(xué)考察 ①精密度：精密吸取決明子（批號(hào)為170401）樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次。結(jié)果顯示橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.38%、1.24%、1.32%、0.49%、0.40%和1.60%，表明儀器精密度良好。

②穩(wěn)定性：取決明子（批號(hào)為170425）的樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、6、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.33%、1.53%、1.28%、0.46%、0.44%、3.72%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

③重復(fù)性：取決明子（批號(hào)為170425）樣品5份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法預(yù)處理，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚百分含量的RSD分別為2.21%、4.85%、3.30%、3.63%、4.83%、4.44%，表明方法精密度良好。

④加樣回收率：取決明子（批號(hào)為170425）的樣品9份，分為3組，每組3份，每組按照橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚已測(cè)得含量的80%、100%、120%精密加入對(duì)照品。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備溶液，按照“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。見表4。

表4 加樣回收率結(jié)果

續(xù)表4

3.2.3 樣品分析 按“2.1.2”的方法對(duì)12批決明子及炒決明子進(jìn)行處理，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件，對(duì)12批決明子及炒決明子中橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚進(jìn)行定量分析，見表5。

表5 決明子及炒決明子6種成分的定量分析（xˉ±s，n=12）

4 討論

在實(shí)驗(yàn)中針對(duì)決明子中蒽醌類化合物這一主要有效成分來進(jìn)行流動(dòng)相的篩選〔7〕，考察了甲醇、乙腈與磷酸、醋酸的混合系統(tǒng)作為流動(dòng)相的梯度洗脫條件，并對(duì)YMC-Pack ODS-A C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）、Synergi Hydro－RP C18（250 mm×4.6 mm，4 μm）、Kinetex XB-C1（8100A，250 mm×4.6 mm）、Agilent TC-C1（8250 mm×4.6 mm，5 μm）等幾種色譜柱的分離效果進(jìn)行了考察，以色譜柱為YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫效果最佳。同時(shí)綜合各蒽醌類化合物的紫外吸收特征，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為287 nm。本實(shí)驗(yàn)中，樣品處理方法參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）〔1〕，但省略了甲醇提取過程并用二氯甲烷代替三氯甲烷進(jìn)行萃取，降低試劑毒性，同時(shí)也滿足決明子及炒決明子未水解處理?xiàng)l件下指紋特征及成分含量比較的要求。

中藥指紋圖譜就其本質(zhì)而言，應(yīng)可視為中藥的一種依賴于不同提取方法所得的活性化學(xué)組分的相對(duì)濃度譜〔8〕，為國(guó)內(nèi)外廣泛接受的一種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）及現(xiàn)有研究多對(duì)決明子及炒決明子進(jìn)行水解處理后的樣品進(jìn)行分析，難以評(píng)價(jià)決明子及炒決明子內(nèi)在化學(xué)成分上的差異。為此，參考有關(guān)文獻(xiàn)〔10-11〕，本實(shí)驗(yàn)建立了12批決明子及炒決明子未水解樣品的指紋圖譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12批決明子與決明子對(duì)照?qǐng)D譜及炒決明子對(duì)照?qǐng)D譜比較，相似度分別為0.94和0.67，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；12批炒決明子與炒決明子對(duì)照?qǐng)D譜及決明子對(duì)照?qǐng)D譜比較，相似度分別為0.92和0.62，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。因此，采用指紋圖譜技術(shù)可進(jìn)行決明子及炒決明子的鑒別。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的決明子間化學(xué)成分有一定差異，因此，應(yīng)按《中藥材生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》和決明子規(guī)范化種植標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程開展決明子藥材的種植生產(chǎn)，以保證藥材質(zhì)量〔12〕。炒決明子相似度較決明子低，可能原因是決明子本身內(nèi)在化學(xué)成分的差異經(jīng)過炒制后更加凸顯。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)決明子及炒決明子中的橙黃決明素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等成分的定量分析結(jié)果表明，決明子及炒決明子未經(jīng)水解處理，炒決明子中6種成分的含量均較決明子高，其中大黃素、大黃酚及大黃素甲醚差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05），說明炒制過程中，部分結(jié)合型苷類成分解離成了苷元，應(yīng)注意炒制過程的質(zhì)量監(jiān)控。鑒于決明子及炒決明子未水解樣品中6種成分含量的差異性，特別是與決明子相比，炒決明子中大黃素、大黃酚及大黃素甲醚差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或0.05）。因此，決明子及炒決明子未水解樣品中大黃素、大黃酚和大黃素甲醚用于決明子炒制前后內(nèi)在成分含量變化的評(píng)價(jià)更為合理。

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