四溴二苯醚與高氯酸鹽聯合暴露對成年斑馬魚肝臟抗氧化系統的影響

任 新，趙雪松，段小月，劉 萍，賈晨夢，龐蒙蒙

(吉林師范大學 環境科學與工程學院，吉林 四平 136000)

高氯酸鹽(Perchlorate，PER)是一種新型持久性無機污染物，常應用于燃料氧化劑和易燃物，也應用于化肥、皮革加工等生活領域[1]。PER極易溶于水，這一特性導致它在自然環境中具有很強的穩定性，易遷移擴散，同時它還具有顯著甲狀腺毒性、遺傳毒性、生殖毒性等，進入生物體內會影響生物體甲狀腺功能，對人體新陳代謝造成極大危害[2-5]。多溴聯苯醚(Poly brominated diphenyl ethers，PBDEs)是一組工業化學物，在人類活動中作為阻燃劑被廣泛使用[6]。PBDEs具有高度疏水親脂性、生物富集性和難降解性等特點，同時又具有典型的甲狀腺毒性、神經毒性以及潛在的生殖毒性[7-9]，致使其成為了一種存在于各類環境介質中甚至存在于人體組織中的環境污染物。PBDEs有209種同系物，其中目前在生物體包括人體組織中檢出率最高的是四溴二苯醚(BDE-47)[10]。

斑馬魚(Danio rerio)是一種熱帶淡水魚，身體細長，體型很小，長約4～6 cm，由于其本身個體小，少量花費便足以支持對其的養殖，而且它繁殖能力強，適合大規模繁育。目前它作為脊椎動物的模型廣泛應用于神經發育毒性的研究，同時也是研究胚胎發育分子機制的優良資源。

多溴聯苯醚在自然環境中廣泛存在，無時無刻不在威脅著各類生物的生命和健康?，F在對多溴聯苯醚的單一毒性研究較多，但在自然界中，污染物往往不是獨立存在的，而是多種污染物同時存在于一個環境體系內影響著環境內的各類生物，所以需要考察聯合污染物的復合毒性。本實驗選取BDE-47與PER為研究對象，以成年斑馬魚為受試生物，系統研究兩種物質對斑馬魚的聯合毒性效應，主要分析對斑馬魚肝臟抗氧化系統的影響，擬為完善復雜水環境的環境毒理學研究提供基礎數據，為進一步進行環境生態風險評價奠定理論基礎。

1 實驗部分

1.1 斑馬魚的養殖

本實驗所用斑馬魚購自中國科學研究院武漢水生所，魚身長約3～4 cm。斑馬魚的養殖方法參照Yu等[8]介紹的養殖方法。將性成熟的斑馬魚養殖于自制的循環消毒系統中，如圖1所示，循環水中加入營養鹽(64.75 mg/L NaHCO3，5.75 mg/L KCl，123.25 mg/L MgSO4·7H2O和294 mg/L CaCl2·2H2O)，并維持水溫在28±1 ℃，pH值為6.85～7.0，光照周期為12 h明/12 h暗。每天兩次投喂經紫外消毒的紅赤蟲，養殖1個月后可進行實驗。

圖1 斑馬魚養殖裝置

1.2 暴露溶液的配制

BDE-47(2，2′，4，4′-tetrabromodi-phenyl ether，Wellington，加拿大，純度>99.9%)不溶于水，故選取二甲基亞楓(DMSO)對BDE-47粉末進行溶解，配制1 mg/mL濃度的BDE-47儲備液，同時配制3.35 mg/L，33.5 mg/L，335 mg/L的PER(Invitrogen，美國，純度99%)溶液。分別在PER溶液中加入不同體積的BDE-47儲備液，稀釋至所需濃度，配制成3種不同濃度的BDE-47與PER的混合液，分別為(BDE-47 8.5+PER 335)mg/L，(BDE-47 0.85+PER 33.5)mg/L，(BDE-47 0.085+PER 3.35)mg/L。將所得的3種濃度的溶液分別裝瓶并標注。稀釋水均為養殖斑馬魚的循環水。

1.3 暴露方法

將成年斑馬魚以每組雌雄各20條的搭配方式置于培養器中進行培養，根據濃度和成分的不同設置11組暴露溶液，分別為3組不同濃度的BDE-47溶液(8.5 mg/L，0.85 mg/L，0.085 mg/L)，3組不同濃度的PER溶液(335 mg/L，33.5 mg/L，3.35 mg/L)，3組不同濃度的聯合暴露溶液(BDE-47 8.5+PER 335)mg/L，(BDE-470.85+PER 33.5)mg/L，(BDE-470.085+PER 3.35)mg/L，實驗同時設置空白對照組以及0.3%的DMSO對照組。暴露14天后對雌雄斑馬魚進行取樣，取樣后提取成年斑馬魚的肝臟，制成10%的組織勻漿進行抗氧化系統的檢測。

1.4 抗氧化系統指標測定方法

在暴露14天后，從各濃度組中分別提取5條雌性成年斑馬魚及5條雄性成年斑馬魚并將其分別開，用MS-222進行麻醉后，提取斑馬魚的肝臟。由于斑馬魚是彌散性肝臟，提取時要注意不能混入脂肪。然后，加入組織塊9倍重量的冷生理鹽水，通過機械勻漿機進行勻漿，取上清液，得到10%的組織勻漿。

抗氧化系統的檢測主要測定斑馬魚肝臟內的超氧化歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽(GSH)活性以及丙二醛(MDA)水平。所有抗氧化酶試劑盒均購自南京建成生物有限公司，測定流程按照說明書嚴格操作。

1.5 數據統計分析

實驗數據使用Kolmogorov-Smirnov進行檢驗分析，并應用Levene’s檢驗分析方差的同質性。所有統計分析應用SPSS 17.0軟件(SPSS，Chicago，USA)進行操作。當p<0.05時，判定存在顯著性差異。實驗數據以平均值±標準差(SEM)給出，所有數據采用Origin 8.0軟件進行數據作圖。

2 結果與討論

2.1 BDE-47與PER復合對成年斑馬魚肝臟SOD活性的影響

超氧化物歧化酶(Orgotein Superoxide Dismutase，SOD)能夠將生物體在新陳代謝中生成的有害物質清除。根據與之結合的金屬離子的種類不同可以分為3種SOD：分別是含銅與鋅超氧化物歧化酶(Cu-ZnSOD)、含鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和含錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)。這3種SOD都能起到催化超氧化物陰離子自由基的作用，并將之歧化為H2O2與O2。當外源物質刺激生物機體，導致生物機體自身的氧化機團增加時，SOD會最先啟動，對氧化機團所造成的損傷進行抵抗[11]。

BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟SOD活性的變化如圖2所示。對于雌雄斑馬魚而言，PER單獨暴露組SOD的活性與對照組相比沒有顯著的變化，而BDE-47單獨暴露以及二者聯合暴露后雌雄斑馬魚肝臟內的SOD活性均隨濃度的增加而增加，而且聯合暴露組SOD的活性高于兩種物質單一暴露。由此可見，PER的加入能夠加劇BDE-47對SOD活性的誘導。同時，雌魚SOD的活性高于雄魚，說明BDE-47與PER聯合暴露對斑馬魚肝臟SOD活性的作用存在性別差異。吉貴祥等[12]對斑馬魚胚胎及幼魚的BDE-47急性毒性實驗也發現，隨著BDE-47暴露濃度的增加，SOD的活性也顯著增強。Albina等[13]研究了BDE-99對成年鼠肝臟與腎臟的氧化激，結果顯示BDE-99能顯著地誘導SOD的活性。

2.2 BDE-47與PER復合對成年斑馬魚肝臟CAT活性的影響

過氧化氫酶(Catelase，CAT)以在過氧化體中存在的形式存在于紅細胞及某些組織內，主要作用是將H2O2催化分解為H2O與O2，使之無法與O2在鐵螯合物催化作用下發生反應，從而避免生成有害的-OH[11]。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖2 BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟SOD活性的變化

說明：*p<0.05和**p<0.01表示暴露組與對照組相比差異顯著(下同)

圖3顯示了暴露14天后雌雄斑馬魚肝臟內CAT的活性。由圖3可知PER暴露組CAT活性沒有顯著的變化，而BDE-47暴露組CAT活性呈現濃度依賴關系，且8.5 mg/L處理組CAT的活性較對照組顯著增加。說明高濃度BDE-47暴露后，胚胎受到外源有毒物質的刺激，胚胎細胞內超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)等ROS顯著增加，為了維持機體自由基的產率與抗氧化系統清除自由基的動態平衡，機體自身CAT啟動。由圖3還可以看出，聯合暴露組也呈現濃度依賴關系，顯著上升出現在0.85 mg/L BDE-47+33.5 mg/L PER暴露組以及8.5 mg/L BDE-47+335 mg/L PER暴露組(p<0.05)。同時，雌性成年斑馬魚與雄性成年斑馬魚的CAT活性變化十分相似，初步判斷該現象與SOD活性同步變化有關，可能是由于CAT協同SOD抵抗氧化脅迫所造成的結果。與單獨暴露組相比，聯合暴露組呈現的高活性CAT表明二者聯合對斑馬魚產生的氧化脅迫程度更強，對CAT的誘導更強。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖3 BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟CAT活性的變化

2.3 BDE-47與PER復合對成年斑馬魚肝臟GSH活性的影響

谷胱甘肽(glutathione；GSH)是一種有抗氧化和整合解毒的三肽，能夠參與生物轉化，將侵入生物機體內的有害毒物轉化并排出體外[11]。BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟GSH活性的變化如圖4所示，對于雌性而言，PER單獨暴露肝臟內GSH活性沒有顯著變化，而8.5 mg/L BDE-47處理組中肝臟內GSH的活性較對照組顯著降低(p<0.05)。表明PER加入后，機體產生多余的自由基由GSH抵消而導致GSH含量降低，說明此時雄性斑馬魚氧化脅迫較大。He等[14]發現，BDE-47暴露能夠使鼠海馬神經元產生氧化應激反應，隨著暴露劑量的增加，GSH濃度也呈現降低趨勢。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖4 BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟GSH活性的變化

2.4 BDE-47與PER復合對成年斑馬魚肝臟MDA水平的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化最重要的產物之一。MDA的含量變化可以反映出機體內脂質過氧化的程度，從而間接反映出細胞損害的程度，相對于魚類模型而言，MDA常作為環境污染物毒性效應的敏感指示物出現在毒理學實驗中。

圖5顯示了BDE-47與PER聯合暴露14天后雌雄魚肝臟內MDA的水平。由圖5可知，對于雄性斑馬魚而言，PER單獨暴露肝臟內的MDA水平均沒有顯著差異；而在BDE-47單一暴露組中，雌雄魚肝臟內MDA的水平均上升且呈現濃度依賴關系，且在高濃度暴露組中MDA水平上升顯著。在聯合暴露組中，MDA均顯著上升并存在劑量效應關系，且大于BDE-47單一暴露組。研究結果表明，BDE-47單一暴露組與聯合暴露組均能誘導肝臟發生脂質過氧化，且聯合暴露組誘導性更強，說明PER能夠加劇BDE-47誘導肝臟產生氧化應激反應。在早期的BDE-47與PER對斑馬魚胚胎氧化應激的研究中也得出了類似結果[15]。吉貴祥等[12]通過實驗也得出了相似結論，MDA含量的變化與BDE-47濃度的變化呈現正相關關系。

(a)雄魚肝臟 (b)雌魚肝臟圖5 BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟MDA水平的變化

3 結論

通過對BDE-47與PER聯合暴露后斑馬魚肝臟SOD，CAT，GSH與MDA抗氧化指標的分析，可見PER加入后的聯合暴露組SOD，CAT的活性以及MDA水平顯著增加，GSH顯著降低，表明PER能加劇BDE-47對抗氧化系統的影響，產生氧化應激反應，加大氧化損傷。

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