淺談建立膿毒癥動物實驗模型的新方法

高 宇，陳 慧，劉艷苓，謝 瑩，張佳麗，欒澤柱，陳桂榮

（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 110033）

膿毒癥（sepsis）是指由感染因素所致的全身炎癥反應綜合征。該病是導致在重癥監護病房接受治療的非心臟病患者死亡的主要原因，其致死率高達28%～47%[1]。膿毒癥動物模型是臨床上對膿毒癥的發病機制和防治方法進行研究所必須的實驗品，也是膿毒癥研究的難點所在。盲腸結扎穿孔術（cecal ligation perforation，CLP）是臨床上制備膿毒癥動物模型的金標準。但是，用CLP制備的膿毒癥動物模型不能完全復制臨床膿毒癥。由于膿毒癥患者最常見的感染源來自腹腔，故近年來，臨床上逐漸嘗試將腹腔感染模型作為常用的膿毒癥動物模型[2]。目前，建立與臨床腸源性膿毒癥的發病機制較為接近的動物實驗模型已成為醫學界研究的新熱點。在本次研究中，筆者采用向模型大鼠的腹腔內注射大鼠糞便勻漿的方法建立腸源性膿毒癥大鼠模型，以期為膿毒癥的研究提供新的參考依據。

1 儀器與方法

1.1 實驗儀器及試劑

1.1.1 實驗儀器 XW-80A微型渦旋混合儀（由上海滬西分析儀器廠有限公司生產）、AS3120A超聲提取器（由天津奧特賽恩斯儀器有限公司生產）、TGL-16C高速離心機（由上海安亭科學儀器廠生產）、Sartorious CP 225D型精密天平（由北京塞多斯儀器系統有限公司生產）、eppendorf可調式移液器（由德國艾本德公司生產）、DCY-24G型氮吹儀（由青島海科儀器有限公司生產）、ACO-328型電磁式空氣壓縮機（由廣東海利集團有限公司生產）、FJ-200高速分散均質機（由上海標本模型廠生產）。

1.1.2 實驗試劑 濃度為95%的乙醇、無水乙醇、脂多糖（LPS）試劑。

1.2 實驗動物

從遼寧長生生物技術有限公司購入60只SD大鼠，其合格證號為SCXK（遼）2015-0001。這60只大鼠均為雌性、SPF級大鼠，其體重為180～220 g。

1.3 實驗方法

1.3.1 對實驗動物進行分組 將這60只SD大鼠采用隨機數表法分為6組，分別為模型組1、模型組2、模型組3、模型組4、模型組5和空白組，每組各有10只大鼠。對這6組大鼠依次進行稱重和編號。

1.3.2 進行內毒素血癥大鼠模型的復制 1）進行糞便勻漿上清液的制備。對這60只SD大鼠進行1周的適應性飼養后，收集其新鮮成形的糞便。對大鼠糞便進行稱量后，向其中加入適量的生理鹽水，然后將該混合物置于勻漿機中進行充分的研磨，制備成濃度為10%的大鼠糞便勻漿。按3000 轉/min的轉速對大鼠糞便勻漿進行5 min的離心處理，得到上清液，然后用注射器吸取適量的上清液備用。2）進行大鼠模型的制備。在進行造模前，使1～5組模型組大鼠禁食12 h，然后按1 ml/200 g的劑量向其腹腔內注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿上清液。在注射完成后，觀察這5組大鼠的體征及表現。這5組大鼠若出現蜷縮、少動、精神萎靡、毛發不榮、寒顫、鼻周有明顯血痕等體征，則表示造模成功。將造模成功的大鼠作為本次的研究對象。

1.3.3 進行血液標本的采集 在5組模型組大鼠造模成功10 h后，從這5組模型組大鼠和空白組大鼠的眼眶靜脈叢各采集0.5 ml的血液，將其血液標本放入肝素化的Ep管中，按5000 r/min的轉速對其血液標本進行10 min的離心處理，得到上清液，然后將上清液放置在-80℃的環境中保存備用。

1.3.4 進行血液標本的處理 精密吸取6組大鼠150 μl的血液，將其血液標本置于容積為2 ml的離心管中，依次向離心管內加入10 μl的內標液異補骨脂素、600 μl的甲醇，然后進行2 min的渦旋，使管內容物充分地混勻。按5000 r/min的轉速對離心管內的混合液進行10 min的離心處理，得到上清液，然后用40 ℃的空氣流吹干上清液，得到上清液殘渣。向上清液殘渣中加入100 μl的甲醇進行復溶，對復溶物進行1 min的超聲處理、2 min的渦旋，然后用型號為0.45 μm的微孔濾膜對復溶物進行濾過。

1.3.5 進行血液樣本的采集和血清LPS水平的測定 在造模完成48 h后，用乙醚對6組大鼠進行麻醉，用無熱原的針筒心尖采集其200 μl的血液。向這6組大鼠的血液標本中加入200 μl的抗凝劑，充分混勻后，將其血液標本置于冰水中，進行5 min的低溫離心處理（轉速為3000 r/min），得到上清液。將大鼠的血液上清液制備成2倍濃度的稀釋液，取 0.1 ml的該稀釋液，向其中加入0.4 ml的樣本處理液后混勻，制成10倍的稀釋液。將該稀釋液放入70 ℃的水浴箱中加熱10 min后取出，再將其放入冰水中進行冷卻。取無熱原試管，向其中加入0.1 ml的細菌內毒素檢查用水、0.1 ml的內毒素標準溶液、0.1 ml的血漿供試品、0.1 ml的鱟試劑溶液，將上述液體混勻后放入37 ℃的水浴箱中溫育10 min。在溫育結束后，向上述的混合液中加入0.1 ml的顯色基質，混勻，對該混合液再次進行6 min的溫育，然后向該混合液中依次加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3（各加入0.5 ml），待混勻后靜置5 min，在λ 545 nm處測定該混合液的吸光度值。上述實驗中所使用的試管、吸頭和保存管均為無熱原耗材。

1.3.6 進行血清TNF-α 和IL-6水平的測定 從這6組大鼠的血液標本中取40 μl的血液，向其中依次加入10 μl生物素標記的二抗、50 μl的酶標試劑，在37℃的環境下反應60 min，并洗板5次，再依次向其中加入顯色液A、顯色液B，在37 ℃的環境下顯色15 min，然后向其中加入終止液，在加入后的10 min內測定其OD值，并根據標準曲線方程計算對應樣品的濃度。

1.3.7 進行臟器組織的病理觀察 迅速對這6組大鼠進行解剖，取其心、肝、脾、肺、腎組織，用生理鹽水對這些臟器組織進行漂洗后，置入濃度為10%的福爾馬林溶液中進行固定。對這6組大鼠的臟器組織進行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察各臟器組織的形態和結構，描述各臟器組織的病理變化情況。從這60只大鼠的心、肝、脾、肺、腎組織中各切去約1 cm3的組織塊進行脫水，然后用石蠟進行包埋。將這些組織塊切成厚度為5 μm的組織切片，對這些組織切片進行脫蠟，用蘇木素-伊紅（HE）對其進行常規染色，用中性樹膠對其進行封片，然后在顯微鏡下對其進行觀察。

1.4 統計學方法

應用SPFF20.0統計軟件對本次研究中的數據進行處理，計量資料用均數±標準差（）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 5組模型組大鼠在造模完成后的臨床體征及表現

在向模型組5組大鼠的腹腔內注射完濃度為10%的大鼠糞便勻漿后，有80%的大鼠出現喜歡聚集成堆、行動能力下降、失去攀爬行為、輕微眼迷離、大便溏稀、對聲音的敏感度減退、不自主寒顫等表現。在注射完成6 h后，這5組大鼠僅在短時間內分散開，仍沒有運動行為，其精神萎靡、眼內分泌物增加、毛發豎起且沒有光澤、呼吸加深加快、不自主寒顫加重，嚴重者甚至出現死亡。這5組大鼠的死亡高峰期主要集中在注射糞便勻漿后的12～48 h之間，在注射完3 d后其不再死亡。在這5組大鼠中，有30%的大鼠在注射完糞便勻漿的數小時后死亡。

2.2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對比

與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清LPS的水平均較高，P＜0.01。

2.3 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對比

在注射大鼠糞便勻漿后，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平迅速升高，且在注射后的6 h達到高峰，在注射后的48 h逐漸降低至正常水平。與空白組大鼠相比，5組模型組大鼠血清IL-6和TNF-α的水平較高，P＜0.05。詳見表2。

表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對比（EU/ml， ）

表1 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清LPS水平的對比（EU/ml， ）

組別（n=10） LPS水平模型組1 2.15±0.08模型組2 2.36±0.04模型組3 2.45±0.03模型組4 2.19±0.04模型組5 2.28±0.03空白組 0

表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對比 （ ng/ml， ）

表2 5組模型組大鼠與空白組大鼠血清IL-6和TNF-α水平的對比 （ ng/ml， ）

組別（n=10） 時間 IL-6 TNF-α模型組5 注射48 h后 203.8±4.52 101.53±2.30模型組4 注射24 h后 280.6±8.44 151.76±2.42模型組3 注射12 h后 244.4±6.26 130.24±1.49模型組2 注射6 h后 338.4±8.33 181.18±3.24模型組1 注射2 h后 463.8±7.42 279.88±1.69空白組 154.6±7.13 69.65±6.98

2.4 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對比

對6組大鼠心、肝、脾、肺、腎的病理切片進行對比后發現，5組模型組大鼠的脾臟受損的程度均較輕，但其心、肝、肺、腎中均發現大量的炎性浸潤，其心、肝、肺、腎受損均較為明顯。詳見圖1。

圖1 5組模型組大鼠與空白組大鼠臟器組織病理切片的對比

3 討論

膿毒癥是指血液中的細菌或病灶將大量的LPS釋放入血液，使血液中LPS的水平超過機體所能承受的上限所引發的一系列病理反應[3-4]。發生燒傷、腸道菌群異位、大面積的嚴重感染、遭受外傷等均可導致膿毒癥發生。近年來，醫學界對膿毒癥的研究日益廣泛。因此，在進行膿毒癥的動物實驗時選擇合適的造模方法，復制與臨床上膿毒癥的發病機制更為相似的病理模型顯得尤為重要[5-6]。

在本次研究中，筆者通過向5組SD大鼠的腹腔內注射濃度為10%的大鼠糞便勻漿，使其發生腹膜感染，從而引發腸道菌群紊亂、異位、內毒素釋放入其血液，進而使其出現膿毒癥的病理狀態。在5組大鼠造模完成48 h后，其血清LPS的水平、血清TNF-α和IL-6的水平均明顯高于空白組大鼠。對這5組模型組大鼠臟器的病理切片進行分析的結果顯示，其心、肝、肺、腎均受到大量炎性因子的浸潤，并出現了明顯的損傷。由此可見，本研究中所使用的造模方法較為接近臨床腸源性膿毒癥的發病機制。而且，該造模方法可顯著降低進行膿毒癥動物實驗研究的成本。

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