外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療中的意義最新進展

劉書中，周 熹，劉 勇，王以朋

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 骨科,北京100730)

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是一種好發于兒童及青少年的原發性惡性骨腫瘤，其發病率約為4.4/100萬，男性多于女性[1]。骨肉瘤好發于長骨干骺端，以股骨遠端、脛骨近端及肱骨近端最為多見。骨肉瘤惡性程度高，具有較強的侵襲和轉移特性，易發生肺轉移，預后較差。隨著新輔助化療和放療技術的廣泛應用，骨肉瘤患者的5年生存率可達60-70%[2]。如何利用新理論、新技術實現骨肉瘤患者的早期診斷及合理治療已成為臨床診療中亟待解決的重點和難點。目前骨肉瘤的發病機制尚未完全闡明，現有研究表明骨肉瘤的發生與基因突變、信號通路異常激活、微小RNA以及長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)的異常調節等多種因素密切相關，深入研究骨肉瘤分子生物學特征對于骨肉瘤的診斷和治療亦具有重要意義[3,4]。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類在真核生物中發現的長度為18-25個核苷酸序列的內源性非編碼小分子單鏈RNA。MiRNA可通過翻譯抑制、降解靶基因mRNA、轉錄調控、介導ceRNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調控網絡等作用機制在機體正常細胞或腫瘤細胞的多種生物學過程中發揮重要作用，包括胚胎發生、細胞增殖、分化、粘附、侵襲、轉移、凋亡的調控等，進而發揮“促癌或抑癌”的功能[3]。近年來，研究表明多種miRNAs在骨肉瘤細胞、腫瘤組織及外周血中均存在異常表達，這些miRNAs為骨肉瘤患者的早期診斷、準確診斷、微創診斷成為可能，并為骨肉瘤患者新型治療方案的制定提供了一定的理論支持，有望成為骨肉瘤診斷及預后判斷的新型生物學標記物及治療靶點。本文就外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療及預后評估領域的最新研究進展做一綜述。

1 miRNA與骨肉瘤

近年來，研究發現miRNAs可參與調節多種生物學過程，并且miRNAs的差異表達與多種惡性腫瘤，如骨肉瘤、胰腺癌、肝細胞癌、肺癌、乳腺癌等的疾病發生、病情進展及患者預后相關[4,5]。多項研究表明部分miRNAs在骨肉瘤細胞系、腫瘤組織及外周血中存在差異表達，并與OS的疾病嚴重程度、惡性表型、化療抵抗和預后密切相關，這些差異表達的miRNAs在OS疾病的衍進過程中發揮促癌基因或抑癌基因的生物學功能[4]。此外，研究者通過定量測定技術已檢測出在骨肉瘤細胞、腫瘤組織及外周血中差異表達的miRNA譜系，一定程度上揭示了miRNA與骨肉瘤疾病發生、發展的密切聯系。Hu等[6]在人骨肉瘤MG-63細胞系中共檢測出268種異常表達的miRNAs，其中miR-9、miR-99、miR-195、miR-148a、miR-181a為過度表達，而miR-143、miR-145、miR-335、miR-539表達水平則呈下調趨勢。Dai等[7]研究發現13種miRNAs在敲除嘌呤/嘧啶核酸內切酶1(APE1)的MG-63細胞系中表達水平發生顯著改變(>2倍)，其中miR-451、miR-1290、miR-765、miR-483-5p、miR-513a-5p、hsa-miR-129-5p和hsa-miR-31表達上調，而miR-29b、miR-197、let-7b、miR-324-5p、let-7i和miR-484則為下調，結果提示APE1是OS細胞中參與調節miRNA表達的關鍵因子。一項在22種OS細胞系中建立的miRNA研究顯示高侵襲性OS細胞系中miR-199b-5p和miR-100-3p表達下調，而miR-155-5p、miR-135b-5p、miR-146a-5p水平上調，并提出miR-135b-5p和miR-146a-5p對骨肉瘤細胞的轉移能力具有一定的預測價值[8]。另一項針對19種人OS細胞系建立的miRNA研究證實miR-9、miR-21、miR-31、miR-196a/b、miR-374a、miR-29、miR-130表達上調，miR-126、miR-486-5p、miR-150、miR-142-3p、miR-223、miR-144、miR-1、miR-195和miR-206水平下調[9]。

隨著miRNA與骨肉瘤相關性研究的逐步深入，越來越多的學者致力于骨肉瘤患者腫瘤組織、外周血中miRNA差異表達譜系的建立，如Gougelet等[10]研究表明在OS患者腫瘤組織中5種miRNAs(miR-92a、miR-99b、miR-132、miR-193a-5p、miR-422a)表達水平下調，并可有助于骨肉瘤患者臨床診斷的確立。Won等[11]利用miRNA芯片技術檢測骨肉瘤瘤體組織與癌旁組織中的miRNA表達情況，研究發現瘤體組織中miR-199b-5p、miR-338-3p、miR-891a、miR-10b、miR-223、miR-150、miR-451表達水平與癌旁組織相比均上調10倍以上，并通過實時定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)技術證實miR-199b-5p、miR-338-3p、miR-891a明顯上調。OUYANG等[12]選取40例骨肉瘤患者及相同數量健康對照者血漿標本，應用qRT-PCR方法測定miRNA的表達水平，結果顯示骨肉瘤患者外周血miR-21水平顯著升高，并且高miR-21水平與高Enneking分期及化療抵抗密切相關。綜上所述，miRNAs表達水平的檢測為OS的精準診斷、合理治療提供了新的研究方向和理論基礎，深入探討miRNAs與骨肉瘤疾病發生、發展的相關性對于骨肉瘤的預后改善具有重要價值。

2 外周血miRNA檢測在骨肉瘤診斷、治療及預后評估中的意義

2.1 miRNA在外周血中的表達及檢測方法

早期診斷對于骨肉瘤患者預后改善具有重要意義，組織病理學檢查是診斷骨肉瘤的金標準，但組織活檢屬有創操作，可增加惡性腫瘤轉移、種植擴散及出血等風險。因此，外周血miRNAs檢測作為一種高準確性、高敏感性、微創性的診斷手段受到了國內外學者的廣泛關注。外周血miRNAs可能來源于凋亡壞死的腫瘤細胞、血細胞、巨噬細胞等的裂解。最新研究顯示外周血miRNAs也可來自組織細胞的主動分泌途徑，成熟的miRNAs在細胞內被脂蛋白包被成外切酶體分泌至細胞外，進入血液循環，因此組織細胞中miRNAs與循環miRNAs必然存在一定的聯系，研究結果表明多種miRNAs在組織和體液中具有相同的變化趨勢[13]。此外，外周血中miRNAs在室溫下過夜、反復凍存、解凍、煮沸、過酸或過堿等惡劣條件下仍可維持穩定，進一步為循環miRNAs替代組織活檢而成為新型生化指標提供了理論基礎[13]。

目前檢測miRNA的方法中應用最為廣泛的是qRT-PCR技術，其優勢包括：(1)可區分miRNA前體與成熟體，只定量具有生物學活性的成熟miRNAs，可精確區分同一家族中序列高度同源的不同miRNAs，并能檢測出只有一個堿基序列差別的不同miRNAs表達水平，靈敏度和特異度均較高；(2)樣品消耗量少，只需要l-l0ng RNA即能檢測出低豐度靶miRNA，定量線性范圍寬；(3)檢測技術相對更為簡便，費用較低，利于在臨床檢測領域大規模推廣[13,14]。

2.2 外周血miRNAs檢測在骨肉瘤診療中的意義

2.2.1外周血miR-25-3p、miR-17檢測在骨肉瘤中的意義

Fujiwara等[15]應用qRT-PCR技術對選取的14位骨肉瘤患者、14位年齡匹配的非骨肉瘤患者及8位健康對照者的血清標本進行檢測，研究發現骨肉瘤患者血清中miR-25-3p表達水平顯著高于非骨肉瘤患者(P=0.004)和健康對照者(P=0.004)，血清miR-25-3p在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中靈敏度為71.4%，特異度為92.3%(AUC=0.868，95% CI=0.743-0.993)，并進一步證實血清miR-25-3p表達水平與骨肉瘤患者病情嚴重程度及預后密切相關。而血清miR-17-5p表達水平在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中靈敏度為64.3%，特異度為 84.6%。在體外試驗中，骨肉瘤細胞miR-25-3p、miR-17-5p的表達水平也顯著升高。Li等[16]選取46名骨肉瘤患者與46名健康對照者外周血樣本進行檢測，研究證實骨肉瘤患者循環血中miR-17表達水平顯著升高，并且與磷酸酶、張力蛋白同系物的水平呈負相關。此外，研究中骨肉瘤患者循環血中miR-17表達水平越高，整體生存期越短，故循環血miR-17水平可作為判斷骨肉瘤患者預后狀況的新型指標，并有望成為骨肉瘤疾病治療的新靶點。Li等[17]將20名治療前骨肉瘤患者與20名健康對照者納入研究，研究結果表明miR-25-3p，miR-106a-5p,miR-16-5p,miR-20a-5p,miR-425-5p,miR-451a,miR139-5p在骨肉瘤患者血清中的表達水平較對照組顯著降低，差異均具有統計學意義。

2.2.2外周血miR-497檢測在骨肉瘤中的意義

Wang等[18]研究發現骨肉瘤患者外周血、腫瘤組織以及肺轉移組織中miR-497表達水平均顯著降低，其表達水平與突觸核蛋白γ呈負相關。Pang等[19]選取185名骨肉瘤患者與130名健康對照者血清樣本進行檢測，研究證實骨肉瘤患者血清中miR-497水平較對照組顯著降低(P<0.001)，血清中miR-497水平與骨肉瘤疾病臨床分期(P=0.001)、遠處轉移(P=0.001)、化療抵抗(P=0.007)密切相關。血清miR-497在鑒別骨肉瘤與非骨肉瘤患者中具有較高的參考價值(AUC=0.848，95% CI=0.773-0.923)，并進一步證實血清miR-497表達水平愈低，患者生存期愈短(P<0.001)。因此，血清中miR-497水平可作為骨肉瘤患者早期診斷、病情評估、預后判斷的新型生化指標。

2.2.3外周血miR-124、miR-27a檢測在骨肉瘤中的意義

Cong等[20]選取114例骨肉瘤患者、40例骨膜炎患者及50例健康對照者，應用qRT-PCR技術檢測血清中miR-124水平，研究發現骨肉瘤組患者血清中miR-124表達水平顯著低于其余兩組(P<0.05)，經手術治療后患者血清中miR-124表達水平較術前明顯增高(P<0.01)，血清中miR-124表達水平與骨肉瘤較高的臨床分期(P=0.0006)、遠處轉移(P=0.0256)直接相關，對骨肉瘤疾病具有良好的鑒別作用(AUC=0.846)，血清miR-124表達水平愈低，患者臨床分期及遠處轉移的發生率愈高，預計生存期愈短。因此，血清中miR-124水平可作為骨肉瘤患者早期篩查、病情評估、預后判斷的獨立預測指標。Xu等[21]研究證實血清中miR-124、miR-27a與骨肉瘤患者的化療敏感性密切相關。對于化療敏感度差的患者，血清miR-124水平顯著降低，而血清miR-27a水平則明顯升高，上述兩種外泌體可在一定程度上預測骨肉瘤患者的化療敏感性。Tang等[22]選取166名骨肉瘤患者與60名健康對照者血清樣本進行檢測，研究證實骨肉瘤患者血清中miR-27a水平較對照組顯著升高(P<0.001)，血清中miR-27a高表達與骨肉瘤較高的臨床分期(P=0.001)、遠處轉移(P=0.01)、化療抵抗(P=0.008)呈正相關，其對骨肉瘤具有良好的鑒別作用(AUC=0.867)。研究進一步證實血清miR-27a表達水平愈低，患者術后無病生存期(P=0.01)、總體生存期(P=0.006)愈短。血清中miR-27a水平有望成為骨肉瘤患者早期篩查、準確診斷、病情評估、預后判斷的新型無創性生化指標。

2.2.4外周血miR-106a、miR-221檢測在骨肉瘤中的意義

Li等[17]研究表明miR-106a-5p在骨肉瘤患者血清中的表達水平較對照組顯著下調，差異具有統計學意義。Nakka等[23]研究表明骨肉瘤組患者血漿中miR-21、miR-221、miR-106a表達水平顯著高于對照組，血漿中miR-21、miR-221、miR-106a表達水平可作為骨肉瘤患者早期篩查、準確診斷、病情評估、預后判斷的新型標記物。Yang等[24]應用qRT-PCR技術檢測骨肉瘤患者血清與腫瘤組織中miR-221表達情況，結果表明骨肉瘤患者血清、腫瘤組織中miR-221水平較對照組顯著降低(P=0.001)，血清中高表達的miR-221水平與較高的臨床分期(P=0.006)、發生遠處轉移(P=0.01)呈正相關。因此，血清miR-221表達水平可作為骨肉瘤患者生存期的獨立預測指標。

2.2.5其他外周血miRNAs檢測在骨肉瘤中的意義

除上述文獻報道的miRNAs以外，其他多種miRNAs在骨肉瘤患者的外周血中均有異常表達，并且其水平與骨肉瘤患者的病情嚴重程度、分級分期、化療敏感性、治療反應及疾病預后均存在密切聯系。多項研究表明外周血miRNAs水平可作為骨肉瘤診斷、病情進展及預后評估的新型生化指標，并有望為骨肉瘤患者的治療提供新的靶點(詳見表1)[15,16,18-21,25-33]。

表1 2016-2017年Pubmed數據庫中文獻報道的外周血miRNAs檢測與骨肉瘤相關性

3 結語及展望

近年來，針對外周血miRNAs的研究已成為國際上熱點研究內容之一，但目前miRNAs與骨肉瘤的臨床相關研究尚缺乏大樣本、多中心的數據論證。由于miRNA作用的多重性，其在骨肉瘤疾病發生、發展中的特異性作用機制等尚需進行深入研究與探討，以期早日應用于臨床。隨著研究的不斷開展，外周血miRNAs檢測將在骨肉瘤的早期診斷、鑒別診斷、預后評估及靶向治療等諸多方面展現出更為廣闊的應用前景。

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