血漿中miR-21的表達在原發性腦淋巴瘤臨床診斷中的意義

王先偉，陳 東，李召磊

(大連市中心醫院 神經外三科，遼寧 大連116033)

微小RNA(miRNA)是內源性非編碼的小分子RNA的一個種類，大約只有18-25 個bp的長度。在動物基因組中，它大多以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式廣泛存在著。它雖然只是占人類基因組的約1%的內容，但是人類將近三成的基因卻受其調節。它不但可作為癌基因存在，也可以作為抑癌基因而起到作用。在Mitchell等人[1]的研究中已證明外周血血漿中存在穩定的miRNA。miR-21是一種廣泛存在于人類組織細胞中的，而且被發現較早的一類微小RNA。越來越多的研究發現miR-21在包括原發性腦淋巴瘤在內的多種實體腫瘤中均表達過高[2，3]，在疾病進展中極其可能發揮著癌基因的作用。在神經外科臨床診斷中原發性腦淋巴瘤與腦膠質母細胞瘤鑒別起來十分困難，本研究通過檢測原發性腦淋巴瘤患者、腦膠質母細胞瘤患者血漿中miR-21的表達，探討其作為原發性腦淋巴瘤淋巴瘤特異性標志物對診斷、療效及預后評價的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑，DL1000 DNA Ladder 均購自大連寶生物試劑公司。TRIzol 試劑購于美國 Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒及2×Tap PCR MasterMix購于天根生化科技有限公司，引物由上海英俊生物技術有限公司設計合成。PCR 儀購于 ABI 公司。

1.2 病例分組

大連市中心醫院神經外科 2015年7月-2017年7月收治的原發性腦淋巴瘤患者20 例，腦膠質母細胞瘤患者20例，男女比例約為1∶1，年齡 22-75歲(中位年齡 50 歲)，均經手術后組織病理學檢查確診。采血時間均為術前。

1.3 標本采集與預處理

采用抗凝管采集所有研究對象外周血5 ml，2000轉離心12 min，將上層血漿轉移至潔凈EP管，再以15000 轉離心12 min，吸取上層血漿于潔凈 EP 管，-80℃凍存備用。

1.4 逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)

取1 ml血漿加入EP管中，75℃加熱5 min，42℃溫育 1 h 后利用TRIzol試劑進行樣本中RNA 的提取與純化，得到純化后的血漿 RNA 樣本。RNAiso后勻漿氯仿抽提，異丙醇沉淀。逆轉錄得cDNA。PCR反應體系：滅菌水 28.75 μl，5×PCR buffer 10 μl，上下游引物各0.5 μl，TaKaRa E×TaqHS 0.25 μl，cDNA 10 μl，共50 μl反應體系。PCR反應條件為：94℃ 5 min，94℃ 45 s，60℃ 50 s，72℃ 50 s，72℃ 10 min，35個循環。取5 μl RT-PCR產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并攝圖，電泳圖像采用gel pro 4.5圖像分析軟件分析平均光密度值，以同一標本的目的基因與GAPDH平均光密度比值反應目的基因mRNA表達水平。

1.5 統計學處理

實驗數據采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析，結果用均數±標準差表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，所有統計均為雙側，顯著性檢驗水準取α=0.05，以P<0.05代表有統計學差異。

2 結果

瓊脂糖凝膠電泳可見條帶為22 bp，有miR-21表達，與腦膠質母細胞瘤組相比，原發性腦淋巴瘤組miR-21表達明顯升高(P<0.01)，兩組間差異顯著，具有統計學意義,見表1。

3 討論

表1 兩組miR-21表達水平比較(x±s)

注：兩組相比，P<0.01

miR-21是一種非常重要的微小RNA，它在多種腫瘤細胞中的表達均出現顯著異常，尤其是在淋巴系統腫瘤中意義非凡，這當然也包括原發性腦淋巴瘤。多種研究證實， miR-21具有重要的臨床意義：它作為一種原癌微小RNA，與多種腫瘤的發生發展密切相關，可用于腫瘤的診斷、治療和預后。然而由于現在人們對 miR-21的轉錄調控機制、靶基因以及其靶基因的作用機制缺乏更加深入的了解，從而無限限制了miR-21在臨床上的應用。

原發性腦淋巴瘤原是臨床上較為罕見的神經系統腫瘤，然而近年來其發病率及檢出率逐漸上升。因為淋巴瘤對于放療及化療敏感，是可治愈的腫瘤，所以準確診斷腦淋巴瘤對本病的治療效果至關重要。在神經外科臨床診斷過程中，手術前的影像學診斷至關重要，而原發性腦淋巴瘤與腦膠質母細胞瘤在增強MRI上影像十分相似，往往二者需要通過術后的病理學來鑒別。這樣一來給患者造成了手術創傷，甚至延誤的病情，因為淋巴瘤可以通過放化療明顯改善。而通過本研究可以發現，若是在術前鑒別診斷困難時，進行外周血的miR-21監測，可以有效判斷出是否為淋巴瘤，進而為診斷提供新思路，避免很多弊端。

本研究發現，血漿中miR-21的表達水平在原發性腦淋巴瘤患者組顯著均高于腦膠質母細胞瘤組。目前已經有研究結果表明[4]：檢測血漿中 miR-21的表達量對淋巴瘤的正確診斷率可達到85.7%。這提示，血漿中檢測 miR-21的表達量有助于早期原發性腦淋巴瘤的診斷，對臨床懷疑為原發性腦淋巴瘤患者，影像學與腦膠質母細胞瘤類似，而且患者無法開顱取病理，化驗其血中miR-21的表達量可以幫助其早期診斷。

參考文獻：

[1]Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，et al．Circulating microRNAs as stable blood based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008,105(30):10513.

[2]Selcuklu SD,Donoghue MT,Spillane C.miR-21 as a key regulator of oncogenic processes[J].Biochem Soc Trans,2009,37(4):918.

[3]張保貴，劉炳亞，燕 敏.miR-21與腫瘤的研究進展[J]．國際外科學雜志，2011，38(4)：262.

[4]葛甜甜，梁 勇，付 蓉,等.淋巴瘤患者血漿中MIR-21、MIR-155、MIR-210的表達及臨床意義[J].中國實驗血液學雜志，2012,20(2):305.