肺癌細胞血管外游走狀況的實驗研究

趙 楠，辛 華，張樂寧，聶海英

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 胸外科，吉林 長春130033)

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個高度選擇性的非隨機生物學過程，包括肺癌細胞與血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)之間一系列復雜的生物學作用。其中肺癌細胞向血管外游走是肺癌血行轉(zhuǎn)移的重要步驟。為此，我們在體外模擬構(gòu)建了肺癌細胞血行轉(zhuǎn)移中的血管外游走過程，并對肺癌細胞的血管外游走狀況加以探討。

1 材料與方法

1.1 實驗所用細胞

在包被有明膠的細胞培養(yǎng)皿上培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell，HUVEC)；4種肺癌細胞分別為：VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ。

1.2 血管內(nèi)皮單細胞層的制備

將3×104個HUVEC加入預先制備膠原凝膠層的細胞培養(yǎng)皿內(nèi)[1]，培養(yǎng)1周，將細胞培養(yǎng)皿放入裝有正負電極的培養(yǎng)容器內(nèi)，與電阻測定儀相連，記錄血管內(nèi)皮單細胞層的電阻值。

1.3 肺癌細胞血管外游走實驗

制成血管內(nèi)皮單細胞層后，分別將1×105個肺癌細胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)加入細胞培養(yǎng)皿內(nèi)；分別在血管內(nèi)皮單細胞層上加入肺癌細胞1 h、3 h、6 h、12 h后除去細胞培養(yǎng)液，將膠原凝膠層及其表面的細胞完整取出，石蠟包埋，制成組織切片，蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)后在光鏡(100×)下分別觀察各種肺癌細胞與HUVEC粘附及游走至膠原凝膠中的狀態(tài)，同時記錄單位長度(5 mm)中穿過HUVEC游走至膠原凝膠中的肺癌細胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 血管內(nèi)皮單細胞層的確認

血管內(nèi)皮單細胞層的電阻值為9.68±2.05 ohm/cm2，與相關研究報道的數(shù)值基本一致[2]，可以認為HUVEC已完全融合生長，在膠原凝膠表面制備成血管內(nèi)皮單細胞層。

2.2 各種肺癌細胞的血管外游走狀況

分別在血管內(nèi)皮單細胞層上加入肺癌細胞(VMRC-LCD、LK-2、A549、RERF-LC-KJ)1 h、3 h、6 h、12 h后，觀察肺癌細胞與HUVEC粘附及游走至膠原凝膠中的狀況。我們觀察到LK-2、A549、RERF-LC-KJ能夠穿過血管內(nèi)皮單細胞層游走浸潤至膠原凝膠層(圖1)，伴隨時間的推移游走至膠原凝膠中的細胞數(shù)量也越來越多；發(fā)現(xiàn)VMRC-LCD與LK-2、A549、RERF-LC-KJ不同，它幾乎不與血管內(nèi)皮細胞發(fā)生粘附，也更不能穿過血管內(nèi)皮細胞游走浸潤至膠原凝膠層(圖2)；分別觀察不同時間段穿過血管內(nèi)皮單細胞層游走至膠原凝膠中的肺癌細胞數(shù)，LK-2均較A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，證明了與A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更強的穿過血管內(nèi)皮的能力(表1)。

圖1 肺癌細胞的血管外游走狀況(LK-2)

圖2 肺癌細胞VMRC-LCD的血管外游走狀況

VMRC-LCDRERF-LC-KJA549LK-21 h03.65±1.213.17±1.157.26±2.18?3 h09.06±2.3510.62±3.8236.07±9.85?6 h021.87±7.3120.69±6.5857.93±11.37?12 h043.92±11.1740.53±11.64102.74±18.64?

注：*LK-2與VMRC-LCD、A549、RERF-LC-KJ相比P<0.05(n=6)

3 討論

肺癌血行轉(zhuǎn)移是一個高度選擇性的非隨機生物學過程，包括肺癌細胞與血管內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)之間一系列復雜的生物學作用。大部分進入血液循環(huán)的肺癌細胞受到機體的免疫系統(tǒng)殺滅和血流的破壞，殘余的很小一部分肺癌細胞到達轉(zhuǎn)移靶器官后會停滯在微血管中，與血管內(nèi)皮細胞相互作用，穿過血管內(nèi)皮，游走至血管外，形成轉(zhuǎn)移灶。

肺癌的血行轉(zhuǎn)移具有器官組織特異性，按發(fā)生率遞減的順序，容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的器官有腦、骨骼、肝臟、腎上腺。這是因為進入血液循環(huán)的肺癌細胞在靶器官穿過血管內(nèi)皮的前提是肺癌細胞與血管內(nèi)皮細胞的特異性粘附[3]。這種特異性粘附的分子基礎是靶器官的內(nèi)皮細胞及細胞外基質(zhì)所表達的粘附分子。粘附分子(adhesion molecules)是介導細胞之間及細胞與細胞外基質(zhì)間粘附作用的一類糖蛋白，與腫瘤細胞的侵襲及血行轉(zhuǎn)移密切相關。根據(jù)粘附分子的結(jié)構(gòu)和功能，可分為:選擇素(selectins)、鈣依賴粘合蛋白(cadherins)、整合蛋白(integrins)、透明質(zhì)酸受體家族(hyaluronic acid receptor family)、免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily)及CD44、血管細胞粘附分子VCAM-l、PECAM-l(CD31)等。這些粘附分子大部分為分布在細胞膜表面的跨膜糖蛋白，還有少部分脂質(zhì)。所有的粘附分子都是以配體-受體相互作用的形式發(fā)揮其生物學效應[4]。實驗中我們證實肺癌細胞VMRC-LCD與其他的肺癌細胞(LK-2、A549、RERF-LC-KJ)不同，它幾乎不與血管內(nèi)皮細胞相粘附，更不能穿過內(nèi)皮細胞游走至膠原凝膠中，這說明VMRC-LCD可能不表達與血管內(nèi)皮細胞相對應粘附分子的配體。

肺癌細胞與靶器官的血管內(nèi)皮細胞粘附著床后的下一步就是穿過血管內(nèi)皮游走至血管外。實驗中我們證實肺癌細胞LK-2、A549、RERF-LC-KJ均可以穿過HUVEC單細胞層游走至膠原凝膠中，并發(fā)現(xiàn)在不同的時間段，LK-2均較A549、RERF-LC-KJ更多地游走至血管外，這說明與A549、RERF-LC-KJ相比LK-2具有更強的穿過血管內(nèi)皮的能力。但肺癌細胞是如何進行血管外游走的目前尚未完全闡明，希望通過我們的研究能夠初步揭示肺癌細胞的血管外游走狀況，并為以后的研究打下基礎。

參考文獻：

[1]Xin H,Han ZG.Functional regulation of endothelial Myosin light chain kinase in extravascular migration of fibrosarcoma cells[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2009,38(2):145.

[2]Han CS,Xin H,Han ZG,et al.Effect of tissue factor in extravascular migration of fibrosarcoma cell[J].Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban,2011,40(2):245.

[3]Kawaguchi T.Organ Preference of Cancer Metastasis and Metastasis- Related Cell Adhesion Molecules Including Carbohydrates[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2016,15(3):164.

[4]Yousefi M,Bahrami T,Salmaninejad A,et al.Lung cancer-associated brain metastasis:Molecular mechanisms and therapeutic options[J].Cell Oncol (Dordr),2017,40(5):419.