甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷后相關炎性因子的影響

梁延鴿，牟艷玲

(1.濟南大學山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，山東 濟南250200；2.山東省醫學科學院藥物研究所，山東省罕少見病重點實驗室，山東 濟南250062)

葛花，中藥名，具有解酒醒脾，止血保肝之功效，常用于傷酒煩熱口渴，頭痛頭暈，脘腹脹滿，吐血，腸風下血等。葛花的主要成分包含葛花苷、尼泊爾鳶尾異黃酮、鳶尾苷等異黃酮[1]。研究指出，葛花苷等成分在體內發揮生物活性的主要原因是因為其可代謝生成尼泊爾鳶尾異黃酮[2,3]。甲胺鳶尾素是葛花苷的代謝形成的新化合物，分子量為357，研究指出，甲胺鳶尾素可有效改善冠狀動脈結扎引發的心肌缺血現狀，明顯提高心肌細胞的存活率[4,5]。本文通過構建異丙腎上腺素致大鼠心肌缺血損傷模型，探究甲胺鳶尾素對損傷模型大鼠相關炎癥因子的影響情況。

1 材料與方法

1.1 動物及藥物

12月齡雄性Wistar大鼠，體重250-320 g，由濟南大學動物中心提供，許可證號：SYXK(魯)20090014。甲胺鳶尾素：淡黃色粉末，純度大于99%，由山東省醫學科學院藥物研究所藥物合成室提供，生產批號：20080901。

1.2 試劑

TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB ELISA試劑盒，上海紀寧生物科技有限公司提供，生產批號分別為：20170109,2017021，20170510,20170408。Bcl-2、NF-κB相關抗體均產美國CST公司，SABC工作液試劑盒為上海瑞齊生物科技有限公司，蘇木精、二甲苯、無水乙醇均由濟南大學實驗室提供。

1.3 儀器

超低溫冰箱(美國Thermo Fisher Scientific公司)，全自動生化分析儀(日立)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯)，組織切片機(德國萊卡)，LEICA-QWIN圖像分析系統(德國萊卡)。

1.4 方法

選取雄性Wistar大鼠60只，適應性喂養一段時間后，隨機分成4組(實驗1組，實驗2組，空白組及模型組)，每組15只，適應性喂養一周后開始灌胃。實驗1組給予甲胺鳶尾素大劑量20 mg/(ml·100 g)灌胃、實驗2組甲胺鳶尾素小劑量10 mg/(ml·100 g)灌胃、模型組和空白組給予1.0 ml/100 g生理鹽水灌胃。連續給藥10 d后，并于1 h，各組(空白組除外)均皮下多點注射鹽酸異丙腎上腺素0.4m g/100 g，給藥的體積為0.8 ml/100 g，制備異丙腎上腺素致大鼠心肌損傷模型。

1.4.1血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的測定

造模成功5 h后，每組大鼠從頸靜脈竇取靜脈血2 ml，3 000 r/min離心10 min，分離血清，-20℃保存，根據放免試劑盒的說明測定TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB含量變化。

1.4.2Bcl-2、NF-κB蛋白免疫組化測定

頸靜脈取血后，迅速處死動物，取新鮮心臟，在心尖部位病變處沿冠狀面取，放入10%的福爾馬林中固定，行Bcl-2、NF-κB蛋白免疫組化研究，操作方法按照說明書進行。

2 結果

2.1 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素損傷大鼠模型血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB的影響

造模后取相應材質檢測，各組分別與空白組對比，其中實驗1、2組及模型組血清TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB明顯升高(P<0.05)。與模型組對比，實驗1、2組血清TNF-α、IL-1β、NF-κB分別明顯降低(P<0.05)，其中實驗1組比實驗2組降低的更加明顯(P<0.01)。與模型組對比，實驗1、2組血清Bcl-2明顯升高(P<0.05)，其中實驗1組比實驗2組升高更加明顯(P<0.01)。(見表1)。

表1 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素損傷大鼠炎癥因子的影響

注：與空白組對比，*P<0.05；與模型組對比，#P<0.05；與實驗2組對比，▲P<0.01。

2.2 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素損傷大鼠Bcl-2蛋白的影響

將各組大鼠進行皮下注射異丙腎上腺素后，與空白組比較，其中模型組大鼠心肌組織中的Bcl-2蛋白升高(P<0.05)，甲胺鳶尾素灌胃的實驗組大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白明顯升高(P<0.01)。(見圖1)

2.3 甲胺鳶尾素對異丙腎上腺素損傷大鼠NF-κB蛋白的影響

將各組大鼠進行皮下注射異丙腎上腺素后，與空白組比較，其中模型組、實驗1、2組大鼠心肌組織中的NF-κB蛋白升高(P<0.05)，與模型組比較，實驗1、2組血清NF-κB蛋白降低(P<0.05)，且實驗1組較實驗2組降低的更加明顯(P<0.01)。(見圖2)

注：*P<0.05，**P<0.01。 A：空白組，B：模型組，C：實驗2組，D：實驗1組

圖1大鼠心肌組織中Bcl-2蛋白水平

注：*P<0.05，**P<0.01。A：空白組，B：模型組，C：實驗2組，D：實驗1組

圖2大鼠心肌組織中NF-κB蛋白水平

3 討論

異丙腎上腺素，是一種β受體激動劑，臨床上常用于支氣管哮喘及心臟房室傳導阻滯。其藥理作用是興奮心臟β1受體，加快心率，擴張冠脈，增加冠脈流量，過量時可引起心律失常和心肌缺血壞死。采用皮下注射異丙腎上腺素，能夠使大鼠的冠脈發生痙攣性收縮，從而提高心肌耗氧量，進而誘發心肌缺血、缺氧、心功能紊亂狀態，即缺血再灌注損傷[6]。心肌組織發生缺血再灌注的損傷機制與炎癥因子的釋放存在密切關系。研究指出，炎癥因子例如TNF-α、IL-1β、Bcl-2、NF-κB等，在心肌的缺血再灌注中起到了重要的作用[7-9]。炎癥因子引發的炎性反應是導致動脈出現粥樣硬化的主要原因，目前臨床上治療冠心病，抗炎干預也是新的研究方向。

心肌細胞的凋亡通路主要為死亡受體通路，死亡受體通路是重要的外源性凋亡通路，目前已知的死亡受體包括：IL-1β、TNF-α、DR3等[10]。TNF-α和IL-1β與受體結合后，可激活caspase-8蛋白并誘導細胞凋亡[11,12]。DR3等在相關受體的結合下，可活化NF-κB誘導細胞凋亡[13,14]。Bcl-2蛋白家族以及NF-κB家族在心肌缺血再灌注損傷中有重要作用，其中Bcl-2蛋白水平表達越高，其抑制細胞凋亡的作用更加顯著[15,16]。Bcl-2的過度表達可以阻斷線粒體傳導通路，起到保護心肌細胞的作用[17,18]。研究發現，下調NF-κB蛋白的表達可以有效減少心肌細胞凋亡情況，有效防止心肌發生缺血再灌注損傷[19]。這說明IL-1β、TNF-α、NF-κ及Bcl-2等因子在心肌缺血再灌注損傷中發揮了重要作用。

本研究酶聯免疫結果顯示：造模后，實驗組、模型組與空白組對比，TNF-α、IL-1β、NF-κB均出現升高現象，這與異丙腎上腺素對心肌細胞的刺激作用有關，但是實驗組與模型組相比，TNF-α、IL-1β、NF-κB反而降低(P<0.05)，而且甲胺鳶尾素大劑量組降低效果要比小劑量組更顯著(P<0.01)，這說明甲胺鳶尾素能夠抑制炎性因子的釋放，有效的降低了TNF-α、IL-1β、NF-κB含量。同時本研究還發現，實驗組、模型組與空白組相比，Bcl-2含量明顯增加(P<0.05)，說明缺血再灌注造成的心肌損傷誘使心肌細胞分泌Bcl-2增多；但是實驗組與模型組對比，Bcl-2含量升高更為明顯，說明甲胺鳶尾素能夠促使心肌細胞分泌Bcl-2參與炎性反應，上調Bcl-2的表達，其中應用大劑量的甲胺鳶尾素作用效果更加明顯(P<0.01)，說明了甲胺鳶尾素對心肌損傷有一定的保護作用。免疫組化結果顯示，在4個組中，Bcl-2以及NF-κB蛋白的表達結果與ELISA結果一致，說明甲胺鳶尾素可以有效調節Bcl-2及NF-κB蛋白的表達，上調Bcl-2基因，抑制NF-κB蛋白釋放，減輕炎癥反應，對心肌缺血再灌注損傷起到保護作用。

綜上所述，甲胺鳶尾素可以有效減少異丙腎上腺素導致的心肌缺血再灌注損傷，重新調節心臟穩態，調節微血管擴張，改善心肌細胞缺血情況，其調劑機制可能與調節炎癥因子的釋放來減輕炎癥反應，如抑制TNF-α、IL-1β因子的表達，上調Bcl-2蛋白，抑制NF-κB蛋白等有關。后續研究我們將從基因方面展開，詳細探究甲胺鳶尾素對缺血再灌注損傷后心肌細胞相關基因表達的干擾作用。

作者簡介：梁延鴿(1988-),女，在職研究生，藥師，研究方向：心腦血管藥理學。

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