流式熒光發(fā)光法及其改進(jìn)技術(shù)的臨床多腫瘤標(biāo)志物樣本結(jié)果對(duì)比分析及評(píng)價(jià)

趙 虹,姚 華，張海山

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春130033)

腫瘤標(biāo)志物(Tumor Marker,TM)是一種由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和釋放，以抗原、酶或激素等代謝產(chǎn)物的形式存在于腫瘤細(xì)胞內(nèi)或體液中的物質(zhì)[1]。由于腫瘤細(xì)胞的生化性質(zhì)及代謝情況與健康細(xì)胞相比表現(xiàn)異常，因此在人的體液、排除物及組織中，腫瘤標(biāo)志物會(huì)出現(xiàn)質(zhì)或量上改變的，故根據(jù)其生化或免疫特性可以識(shí)別或診斷腫瘤的狀況。臨床上腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)主要應(yīng)用于對(duì)正常人群健康查體與原發(fā)腫瘤的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷、腫瘤發(fā)展程度判斷、腫瘤治療效果觀察評(píng)價(jià)、腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后監(jiān)測(cè)等[2,3]。

腫瘤標(biāo)志物可分為腫瘤細(xì)胞分泌物和腫瘤細(xì)胞表達(dá)物兩類[4]。前者是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生的物質(zhì)，與腫瘤發(fā)展程度正相關(guān)；后者則是腫瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)上的某些特殊結(jié)構(gòu)點(diǎn)，在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)多、正常細(xì)胞表面表達(dá)少，同時(shí)與某些藥物能進(jìn)行特異性識(shí)別與結(jié)合，是可作為藥物靶點(diǎn)的一類標(biāo)志物[5]。腫瘤細(xì)胞分泌物由于能分布在外周血清中，樣本容易獲得，檢測(cè)方法相對(duì)成熟簡(jiǎn)單，因此臨床上主要對(duì)腫瘤細(xì)胞分泌物進(jìn)行檢測(cè)。而由于大部分單個(gè)標(biāo)志物敏感性或特異性偏低，不能滿足臨床上的需求，因此理論上和實(shí)踐上都提倡對(duì)患者進(jìn)行多項(xiàng)標(biāo)志物的聯(lián)合篩查。多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用可提高檢測(cè)結(jié)果的特異性與準(zhǔn)確性及敏感性，更有助于亞臨床腫瘤患者的發(fā)現(xiàn)及預(yù)后分析。表1中介紹了常見(jiàn)腫瘤疾病與相關(guān)腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。

表1 腫瘤與其主要相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物

現(xiàn)常用的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)方法有酶免疫分析法、時(shí)間分辨熒光法、化學(xué)發(fā)光法、放射免疫法、電化學(xué)發(fā)光法、液態(tài)芯片法等[6-8]。流式熒光發(fā)光法，又稱液態(tài)芯片技術(shù)，是美國(guó)Luminex公司于本世紀(jì)初研制出的后基因組時(shí)代技術(shù)平臺(tái)，基于多功能流式點(diǎn)陣儀的懸浮陣列技術(shù)，使其成為一個(gè)多功能、多指標(biāo)并行的分析系統(tǒng)[9]。它有機(jī)地整和了編碼微球(color-coded beads)、激光技術(shù)、應(yīng)用流體學(xué)、高速數(shù)字信號(hào)處理與計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則，造就了高度的檢測(cè)特異性和靈敏度，可廣泛應(yīng)用于免疫分析、核酸研究、酶學(xué)分析、受體和配體識(shí)別分析等研究。是目前美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)，唯一得到權(quán)威機(jī)構(gòu)和醫(yī)學(xué)界共同認(rèn)可用于臨床檢驗(yàn)診斷的生物芯片平臺(tái)。

該技術(shù)的檢驗(yàn)原理為雙抗體夾心流式熒光免疫檢測(cè)法[10,11]。將針對(duì)各種抗原的捕獲抗體通過(guò)共價(jià)交聯(lián)的方式包被在熒光編碼微球上，制成微球懸液，，當(dāng)血清中樣本在37℃反應(yīng)后，加入經(jīng)藻紅蛋白(R-phycoerythrin,PE)的檢測(cè)抗體溶液，再次經(jīng)37℃孵育后，最終形成(微球-捕獲抗體)-抗原-(檢測(cè)抗體-PE)的復(fù)合物。檢測(cè)時(shí)，使單個(gè)的微球通過(guò)檢測(cè)通道,并使用雙色激光同時(shí)對(duì)微球上的兩種熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)。一束激光判定微球的編碼，從而決定被測(cè)物質(zhì)的種類；另一束激光測(cè)定微球上PE的熒光強(qiáng)度，從而反映被測(cè)物質(zhì)的含量。該技術(shù)所需樣本量少，并實(shí)現(xiàn)了高通量、高速檢測(cè)多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的目的，且具有靈敏度高、線性范圍廣、重復(fù)性好、成本低、操作方便等特點(diǎn)，已逐漸在臨床中廣泛應(yīng)用。

通常檢測(cè)微球采用聚苯乙烯(polystyrene)制作，粒徑為5.6 μm，且儀器需至少捕獲100微球才能準(zhǔn)確測(cè)定相關(guān)項(xiàng)目。經(jīng)過(guò)技術(shù)改進(jìn)后，應(yīng)用于Tesmi F3999的全自動(dòng)檢測(cè)試劑盒中的編碼微球采用磁性材料，能夠使編碼微球更順利通過(guò)檢測(cè)儀器，只需30微球數(shù)即可進(jìn)行檢測(cè)，使試劑盒中的每項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的讀數(shù)時(shí)間可控制在30s以內(nèi)，進(jìn)一步縮短了檢測(cè)時(shí)間。儀器設(shè)置全封閉試劑槽，并具有實(shí)時(shí)渦旋混勻系統(tǒng)，使微球懸液組成更加均一穩(wěn)定；增設(shè)密封膠墊防試劑揮發(fā)同時(shí)可以隔絕外源物質(zhì)對(duì)試劑可能造成的污染，可進(jìn)一步保證檢測(cè)數(shù)值的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。且儀器在檢測(cè)過(guò)程中增加了實(shí)時(shí)清洗步驟，可進(jìn)一步減少血清學(xué)檢測(cè)中的干擾項(xiàng)目，如甘油三脂、高膽紅素血癥、溶血(血紅蛋白)等的影響，延長(zhǎng)檢測(cè)儀器的使用壽命同時(shí)擴(kuò)大了樣本的適用檢測(cè)范圍。通過(guò)改進(jìn)技術(shù)升級(jí)后，流式熒光發(fā)光法將能夠更加廣泛的應(yīng)用到臨床檢測(cè)當(dāng)中。

本文采用國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心批號(hào)為201712和201723的臨床室間質(zhì)控樣品，分別用Luminex 200半自動(dòng)檢測(cè)儀器及對(duì)應(yīng)試劑盒與Tesmi F3999全自動(dòng)檢測(cè)儀器及對(duì)應(yīng)試劑盒分別進(jìn)11種多腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方式的準(zhǔn)確性。用同一混合血清樣本進(jìn)行連續(xù)10次測(cè)定，評(píng)價(jià)檢測(cè)穩(wěn)定性。同時(shí)對(duì)臨床樣本42例，其中男性22例，女性20例。用配置Q-Hand智能加樣臂的Luminex 200 半自動(dòng)檢測(cè)儀器和改進(jìn)技術(shù)后的Tesmi F3999的全自動(dòng)檢測(cè)儀器，分別進(jìn)行12項(xiàng)(男性)和10項(xiàng)(女性)的多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，包括鱗狀細(xì)胞癌抗原 SCCA，糖類抗原 CA19-9，糖類抗原 CA15-3，游離/總前列腺特異抗原 T-PSA/F-PSA，甲胎蛋白AFP，腫瘤相關(guān)糖類抗原 CA24-2，血清癌胚抗原CEA，神經(jīng)元特異性烯醇化酶 NSE，游離β亞單位人絨毛膜促性腺激素 Free-β-HCG，細(xì)胞角蛋白19片段CYFRA21-1，癌抗原CA125，本文重點(diǎn)對(duì)兩種實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性與結(jié)果進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。結(jié)合臨床信息，討論臨床意義及推廣可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

使用儀器為L(zhǎng)uminex 200多功能流式點(diǎn)陣儀(Luminex公司，美國(guó))配置Q-Hand半自動(dòng)加樣系統(tǒng)，以及Tesmi F3999全自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)(上海透景生命科技股份有限公司)。使用檢測(cè)試劑盒為兩種儀器相應(yīng)配套試劑，均為上海透景公司生產(chǎn)(批號(hào)：半自動(dòng)儀器檢測(cè)試劑批號(hào)/全自動(dòng)儀器檢測(cè)試劑批號(hào))：多腫瘤標(biāo)志物(7種)檢測(cè)試劑盒(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2016第3400541批號(hào)：LP110280Z-160901/LP120280-170102)糖類抗原19-9定量檢測(cè)試劑盒(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400427批號(hào)：LP110530G-160901/ LP121110-161101)鱗狀細(xì)胞癌抗原檢測(cè)試劑盒(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400430批號(hào)：LP110530G-160901/LP121160-170101)游離/總前列腺特異抗原檢測(cè)試劑盒(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2016第3400544批號(hào)：LP110530G-160901/LP120050-161002)糖類抗原15-3定量檢測(cè)試劑盒(國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400428批號(hào)：LP111020A-160901/ LP121020-161201)。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本

本文臨床樣本來(lái)源為吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院。選取42例臨床樣本，其中男性22例，女性20例。男性樣本平均年齡70.8歲；女性樣本平均年齡66.3歲。

男性患者樣本進(jìn)行12項(xiàng)多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，女性患者樣本進(jìn)行10項(xiàng)多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)，另外選取一份混合樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性測(cè)試。用衛(wèi)生計(jì)生委臨床室間質(zhì)控品201712，201723對(duì)兩種方法的準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3 檢測(cè)方法

Luminex 200半自動(dòng)檢測(cè)方法：使用前充分混勻各種試劑，在96孔反應(yīng)板中每孔依次加入反應(yīng)緩沖液(A)25 μl及血清樣本10 μl，其中糖類抗原15-3(CA15-3)檢測(cè)需用抗原稀釋液(E)將血清樣本稀釋20倍后加入10 μl；震蕩混合20 s后，加入PE標(biāo)記的二抗溶液(B)25 μl；震蕩20 s后反應(yīng)5 min，即加入微球懸液(C)25 μl，再次震蕩20 s混勻，隨后37℃反應(yīng)1 h；反應(yīng)結(jié)束后加入終止液(D)100 μl，充分混勻后于2 h以內(nèi)以Luminex 200流式點(diǎn)陣儀進(jìn)行檢測(cè)。

Tesmi F3999全自動(dòng)檢測(cè)方法：在反應(yīng)杯中依次加入反應(yīng)緩沖液(A)20 μl，血清樣本20 μl，其中糖類抗原15-3(CA15-3)檢測(cè)需用抗原稀釋液(E)將血清樣本稀釋40倍后，按20 μl加入；隨后加入微球懸液(B)20 μl，加樣結(jié)束后充分混勻，置于37℃后避光反應(yīng)25 min；加入熒光標(biāo)記的二抗溶液(C)20 μl于37℃繼續(xù)反應(yīng)15 min，反應(yīng)結(jié)束后加終止液(D)80 μl，由檢測(cè)儀器Tesmi F3999檢測(cè)并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

檢測(cè)微球通過(guò)鞘流液攜帶至檢測(cè)區(qū)，微球混懸液從毛細(xì)管噴出，同時(shí)與四周流出的鞘液一起流過(guò)檢測(cè)區(qū)，微球混懸液在中間形成單個(gè)排列的微球流束，四周被鞘液圍繞。通過(guò)激光識(shí)別至不同的白色斑點(diǎn)區(qū)域，當(dāng)儀器捕獲足夠數(shù)量編碼微球后，將進(jìn)行熒光定量分析，獲得定量檢測(cè)結(jié)果。

2.1 多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線

兩種檢測(cè)儀器獲得的12項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性相關(guān)系數(shù)(R)如表2所示，結(jié)果可以看出，改進(jìn)技術(shù)后的Tesmi F3999全自動(dòng)分析系統(tǒng)，其獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性更為優(yōu)良。

表2 流式熒光發(fā)光法獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

選取同一混合血清樣本，分別用Luminex 200 和Tesmi F3999進(jìn)行半自動(dòng)與全自動(dòng)加樣檢測(cè)。連續(xù)測(cè)定10天，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。兩種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD <10%，穩(wěn)定性符合檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，技術(shù)改進(jìn)的Tesmi F3999全自動(dòng)流式熒光檢測(cè)方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差更低，說(shuō)明其檢驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性更好。

表3 兩種儀器流式熒光發(fā)光法穩(wěn)定性分析

2.3 準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)

質(zhì)控樣本為國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心2017室間質(zhì)評(píng)樣本201712和201723。質(zhì)控樣本為高低兩種濃度，分別用Luminex 200 和Tesmi F3999，共進(jìn)行11項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果如表4所示。兩種實(shí)驗(yàn)儀器的流式熒光發(fā)光法結(jié)果皆能保證測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD<10%，與半自動(dòng)檢測(cè)的Luminex 200檢測(cè)結(jié)果相比，改進(jìn)技術(shù)后的Tesmi F3999檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差更小，說(shuō)明準(zhǔn)確度有所提升。

表4 兩種儀器檢測(cè)方法準(zhǔn)確性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)所有42例臨床樣本分別進(jìn)行的Luminex 200(原技術(shù))和Tesmi F3999(改進(jìn)技術(shù))兩種方式流式熒光發(fā)光法檢測(cè)。陽(yáng)性檢出項(xiàng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。42例樣本中男性樣本22例，女性樣本20例；消化系統(tǒng)腫瘤及相關(guān)疾病樣本17例，呼吸系統(tǒng)腫瘤及相關(guān)疾病14例，腎病及相關(guān)腫瘤6例；其他樣本數(shù)。從12項(xiàng)(男性)和10項(xiàng)(女性)多腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果上看，兩種方式的陽(yáng)性檢出項(xiàng)基本相同。兩種流式熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)臨床樣本表現(xiàn)了優(yōu)良的特異性，證明了腫瘤標(biāo)志物在實(shí)際臨床應(yīng)用上能夠發(fā)揮其重要意義，輔助腫瘤的判斷和相關(guān)治療。

表5 臨床樣本流式熒光法檢測(cè)結(jié)果分析(陽(yáng)性檢出項(xiàng))

總標(biāo)本消化系統(tǒng) 17例原技術(shù)檢出率改進(jìn)技術(shù)檢出率呼吸系統(tǒng) 14例原技術(shù)檢出率改進(jìn)技術(shù)檢出率腎臟系統(tǒng) 6例原技術(shù)檢出率改進(jìn)技術(shù)檢出率CA19-91164.7%1270.1%535.7%535.7%233.3%466.7%NSE529.4%423.5%964.2%750.0%233.3%116.6%CEA741.2%741.2%1392.9%1178.6%233.3%233.3%CA1251164.7%1270.1%1071.4%1285.7%233.3%233.3%free-β-HCG----17.1%17.1%----Cyfra21-11164.7%1270.1%964.3%857.1%583.3%583.3%AFP211.8%211.8%----116.6%116.6%F-PSA15.9%211.8%17.1%17.1%116.6%0-T-PSA211.8%211.8%17.1%17.1%----SCCA15.9%15.9%214.3%321.4%233.3%350.0%CA24-2741.2%847.1%642.9%535.7%116.6%233.3%CA15-3317.6%317.6%428.6%321.4%----

3 討論

本文通過(guò)流式熒光發(fā)光法對(duì)42例臨床樣本進(jìn)行多腫瘤標(biāo)志物的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，分別使用Luminex 200及Tesmi F3999兩種檢測(cè)儀器及配套試劑盒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，改進(jìn)技術(shù)的全自動(dòng)Tesmi F3999檢測(cè)方法所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)穩(wěn)定性更強(qiáng)，準(zhǔn)確度更高，能夠更好的應(yīng)用于臨床檢測(cè)。另外Tesmi F3999配套的檢測(cè)試劑中的編碼微球由聚乙烯微球改進(jìn)為磁性微球，；全密封試劑倉(cāng)除有效保證試劑不會(huì)被外源物質(zhì)污染之外，還能對(duì)檢測(cè)試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)渦旋混勻，保證微球懸液的穩(wěn)定性，從而提高微球識(shí)別及檢測(cè)速度，降低檢測(cè)誤差。另外，Tesmi F3999全自動(dòng)檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)速度大幅的提高，最高可達(dá)到120樣本/h，檢測(cè)效率幾乎是目前傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光儀器的10倍以上。臨床42項(xiàng)實(shí)例反應(yīng)出的結(jié)果也說(shuō)明，流式熒光發(fā)光法，即液態(tài)芯片及其改進(jìn)技術(shù)，具備陽(yáng)性指標(biāo)檢出靈敏性，有利于臨床進(jìn)行高通量的多項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合篩查，有助于正常人群健康查體與原發(fā)腫瘤的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、腫瘤高危人群的篩選、良性和惡性腫瘤的鑒別診斷，是腫瘤發(fā)展程度判斷、腫瘤治療效果觀察評(píng)價(jià)、腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后監(jiān)測(cè)的有效手段。

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