HIF-1α、TGF-β表達與尿路移行上皮癌進展的相關性分析

王民增,徐俊楠,韓 勇,白雪娟,李聰然,李 響*

(1.玉田縣人民醫院 泌尿外科，河北 玉田064100；2.解放軍第309醫院 泌尿外科，北京100091；3.解放軍第309醫院 病理科，北京100091)

細胞代謝旺盛的腫瘤細胞經常面臨細胞微環境的缺氧，后者誘導HIF-1α上調，通過改變代謝方式、誘導血管新生，增加血管通透性等環節克服缺氧環境；同時缺氧上調轉換生長因子(transforming growth factor,TGF-β)的表達，誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，在間質浸潤、遠處轉移和腫瘤耐藥基因蛋白的表達等方面發揮重要的調控作用。新近研究顯示TGF-β是該信號途徑的重要因子，但是在尿路移行上皮癌中的表達以及與上皮間質轉換的關系少見報道。因此本實驗選擇不同病變階段的尿路移行細胞腫瘤，利用組織芯片和免疫組化技術檢測組織中HIF-1α、TGF-β的表達，為尿路移行上皮癌研究和臨床治療提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1臨床資料收集解放軍第309醫院2011年1月-2016 年12月間經尿道膀胱腫瘤電切術和腹腔鏡膀胱癌根治性切除術切除的尿路移行上皮癌標本90例，其中，男51例，女39例，平均年齡63(45-74)歲。低級別移行上皮癌30例(浸潤淺肌層24例，深肌層6例)、高級別移行上皮癌浸潤淺肌層和深肌層各30例；外生型腫瘤64例，內生型腫瘤26例；腫瘤直徑≤4 cm 65例，大于4 cm共25例； TNM分期Ⅰ+Ⅱ期56例，Ⅲ、Ⅳ期34例；淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移59例；脈管內癌栓陽性40例，無脈管內癌栓50例。

1.2尿路移行上皮癌組織芯片的構建復習HE切片并再次確診具體切片，在相應蠟塊上打點標記目標組織 1-2處，解放軍第 309醫院病理科制作組織芯片：用組織芯片點樣儀在空白蠟塊上打孔，每個組織芯片孔柱直徑2.0 mm，在做標記的腫瘤蠟塊上鉆取目標組織植入空白蠟塊相對應的孔內，設計組織陳列點數共60個，待全部目標組織植入后，將蠟塊置55 ℃烘烤2 h，使目標組織與受體蠟塊完全融合。冷卻至室溫后，凍存30 min，作3 μm連續切片，62 ℃烘烤3 h，備用。

1.3試劑和免疫組織化學染色

HIF-1α、TGF-β鼠抗人單克隆抗體購自武漢博士德試劑公司，進口分裝型，包裝0.1 ml，濃縮液，建議工作濃度1∶100。二抗、三抗及封閉血清購自北京中山金橋試劑公司。主要免疫組化步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，微波爐進行抗原熱修復，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗 、三抗各1 h，DAB顯色10-15 min，復染核脫水透明，中性樹膠封片。結果判斷:著色細胞<30%為陰性,≥30%為陽性。HIF-1α、TGF-β陽性物質均定位在細胞漿。PBS代替一抗作陰性對照，公司提供的陽性片作陽性對照。

1.4HIF-1α、TGF-β表達水平的定量分析選取陽性切片，采用HIPAS100圖象分析軟件對所有切片進行圖象分析，先在切片的陰性區域設置視場底色灰度，然后利用低倍鏡尋找每張切片著色均勻的典型區域，每張切片隨機選取10個著色典型區域且不重復的視場，放大400倍鏡下測量每個視場中陽性灰度單位，取其均數即為該切片的著色強度(即灰度單位)。

1.5統計學方法

應用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析。計數資料采用卡方檢驗，不同組間表達率的比較采用Fisher精確概率法，計量資料采用t檢驗，各指標表達水平與臨床病理參數間的關系作直線回歸相關分析。以α=0.05作為具有統計學意義。

2 結果

2.1HIF-1α、TGF-β在移行細胞癌發展不同階段中陽性率的比較

低級別和高級別尿路上皮癌中均存在HIF-1α的表達，陽性率分別為33%(10/30)和67%(40/60)，差別具有統計學意義(P<0.05)；TGF-β在低級別和高級別尿路上皮癌中的陽性率分別為30%(9/30)和70%(42/60)，差別具有統計學意義(P<0.05)。

2.2HIF-1α、TGF-β陽性表達水平與移行細胞癌臨床病理參數關系的相關性

HIF-1α表達水平與組織學類型、浸潤深度、淋巴結轉移密切正相關(P<0.05)，與腫瘤體積、脈管內癌栓、TNM分期無關(P>0.05)；TGF-β表達水平與腫瘤體積、脈管內癌栓、組織學類型密切相關(P<0.05)，與淋巴結轉移、TNM分期、浸潤深度無關(P>0.05)。見表1。

2.3HIF-1α、TGF-β在移行細胞癌不同病變中的表達水平的相關性分析

HIF-1α、TGF-β表達水平在低級別移行上皮癌中不存在明顯相關(r=0.2802P>0.05)；在高級別移行上皮癌中存在明顯正相關(r=0.7803P<0.05)。

表1 HIF-1α、TGF-β在移行細胞癌的表達水平與臨床病理參數的關系

注：tα代表HIF-1α；tβ代表TGF-β。

3 討論

移行細胞癌包括低級別和高級別移行上皮癌，一般規律是低級別尿路上皮癌出現肌層浸潤和淋巴結轉移的機率低，而高級別尿路上皮癌極易出現肌層的浸潤，在隨訪中出現復發和癌癥進展的機率明顯增加，腫瘤浸潤程度、組織學類型、腫瘤數目、復發等是移行細胞癌惡性進展的重要影響因素[1]。惡性腫瘤細胞在生長過程中出現的局部乏氧導致細胞外微環境條件的改變，誘導HIF-1的高表達，后者不僅通過改變惡性腫瘤細胞的代謝方式為細胞供能，同時啟動血管新生增加局部微血管密度，且研究發現高表達HIF-1的腫瘤細胞局部出現放化療的耐受，因此缺氧環節的啟動是腫瘤惡性變的關鍵環節。另有新近研究發現乏氧還通過TGF-β、Notch、miRNAS、Wnt等信號途徑導致細胞的EMT過程，進一步促進腫瘤細胞耐藥的發生，導致腫瘤惡性進展[2]。

HIF-1是一種轉錄因子，主要以異源二聚體的形式存在，由α亞基(HIF-1α)和β亞基(HIF-1β)組成，氧對HIF-1活性的調節主要通過HIF-1α。HIF-1α在正常氧分壓時極不穩定，易被泛素依賴的蛋白水解酶降解；但在細胞外微環境缺氧、生長因子作用等因素的刺激下，細胞中的HIF-1α性質穩定下來，與另一亞單位HIF-1β緊密結合，作用于結構基因的調控序列，促進下游基因的轉錄，如VEGF、紅細胞生成素(EPO)、NOS和糖酵解酶等，使組織細胞對缺氧產生適應性調節[3,4]。另有研究發現作為細胞外基質降解主要酶類的MMP-2在大鼠肝星狀細胞中的表達及活性與HIF-1α表達密切相關，且通過對大鼠MMP-2基因序列的研究發現其5′端基因序列帶有典型的HIF-1結合位點，認為MMP-2 是HIF-1的下游分子，HIF-1α通過上述多種途徑誘導細胞的血管新生和代謝方式改變[5]。本研究低級別和高級別尿路上皮癌中均存在HIF-1α的表達，陽性率分別為33%(10/30)和67%(40/60)，差別具有統計學意義(P<0.05)；HIF-1α表達水平與組織學類型、浸潤深度、淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)，與腫瘤體積、脈管內癌栓、TNM分期無關(P>0.05)。提示隨移行上皮癌惡性進展，缺氧誘導因子明顯表達上調，從而可能通過促進血管新生、代謝趨向無氧酵解、細胞外基質浸潤等方式使腫瘤細胞克服不利生存環境，從而促進腫瘤的進展。

TGF-β通過TGFβ-TβR-P21-ras-MEK-ERK通路參與MAPK通路的信號傳導[6,7]。當活性的TGF-β1與細胞膜表面的TGF-βRⅠ、Ⅱ結合后，活化P21-ras-raf-MEK1/2-ERK1/2通路，MEK1/2(MAPKK)磷酸化ERK1/2(MAPK)，進而由磷酸化的ERK1/2進入細胞核，在各種轉錄因子如Elk1、SRF、SAP-1a、c-Myc、STAT等參與下，改變靶基因轉錄。但由于不同的細胞有不同的轉錄因子，從而出現完全不同的生物學效應。對上皮來源的細胞表現為生長抑制，而對間充質來源的細胞卻表現為明確的生長促進作用，兩者作用完全相反。在乳腺癌研究結果顯示TGF-β1表達水平越高,癌細胞浸潤轉移的能力越強,癌癥相關的死亡率越高.這種聯系與患者年齡、腫瘤大小和雌激素受體水平無關； 對結腸癌、肝癌、胃癌、肺癌和前列腺癌的體外和體內研究也得到類似的結果。有研究發現阻斷TGF-β信號傳導通路能夠減少腫瘤的轉移，運用截短的Smads2/3顯負性突變體抑制乳腺腫瘤細胞系的TGF-β信號通路,結果發現腫瘤細胞的轉移能力被抑制。結腸癌的微衛星不穩定性研究發現,TβRⅡ無活性的突變,使轉移減少,增加了患者術后的存活率,將TβRⅡ基因的cDNA轉染到TβR表達缺失的大腸癌細胞中,這些細胞生長率降低,但強刺激了細胞的浸潤和轉移能力[8]。 最近通過對TGF-β在MMTV/neu轉基因鼠乳腺癌發生和肺轉移中的作用的研究,發現持續激活TGF-β信號傳導能夠延長乳腺腫瘤形成的潛伏期,但同時增加了血管外的肺轉移[9]。本研究發現TGF-β在低級別和高級別尿路上皮癌中的陽性率分別為30%(9/30)和70%(42/60)，差別具有統計學意義(P<0.05)；同時TGF-β表達水平與腫瘤體積、脈管內癌栓、組織學類型密切相關(P<0.05)，與淋巴結轉移、TNM分期、浸潤深度無關(P>0.05)。本研究提示TGF-β對移行上皮癌的惡性進展起促進作用，利于腫瘤細胞間質浸潤和脈管內轉移。

采用直線回歸分析顯示低級別移行上皮癌中HIF-1α、TGF-β表達水平間不存在明顯相關，而在高級別移行上皮癌中存在明顯正相關。提示HIF-1α、TGF-β表達與移行上皮癌惡性進展密切相關，可參與血管新生、上皮間質轉換等多個環節，但在低級別腫瘤中兩者的協同作用并不明顯。

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