超高效液相色譜-串聯質譜法測定肉類中的6種糖皮質激素

王 躍

（哈爾濱市食品藥品檢驗檢測中心，黑龍江哈爾濱 150001）

0 引言

糖皮質激素，又名“腎上腺皮質激素”，是腎上腺皮質分泌的一類甾體激素，也可由化學方法人工合成，不僅具有抗菌消炎的作用，還具有調節糖類、蛋白質和脂肪的代謝作用。近年來，糖皮質激素在獸醫臨床上被廣泛應用，并且臨床用藥量逐年增加，而其毒副作用常被忽視，濫用現象十分嚴重，長期大量使用會引起物質代謝紊亂和水鹽代謝紊亂，出現類腎上腺皮質功能亢進綜合征[1-3]。長期食用獸藥殘留的食品，會造成獸藥在體內蓄積，當其濃度達到一定量時，會擾亂體內激素分泌、降低機體免疫力，造成肌肉萎縮無力、骨質疏松和生長遲緩等直接危害，而且還會出現發熱、軟弱無力、精神沉郁、食欲不振，血糖和血壓下降等急性或慢性中毒癥狀[4-9]。因此建立有效、快速的方法檢測禽畜肉類中的糖皮質激素的殘留具有重大意義。

1 試驗部分

1.1 儀器

T-QS型液相色譜-串聯質譜儀，美國沃特世公司產品；XS-105型電子分析天平，瑞士梅特勒公司產品；XH-B型渦旋混合機，江蘇康健醫療用品有限公司產品；HSC-12B型氮吹儀，天津恒奧科技公司產品；P-12型平行蒸發儀，瑞士步琦公司產品；固相萃取裝置，美國安捷倫科技公司產品；KQ-100DE型超聲清洗機，湖北生化科技設備公司產品；TG16-WS型離心機，湖北湘儀實驗儀器開發有限公司產品；固相萃取柱，美國沃特世公司產品。

1.2 對照品及試劑試藥

曲安西龍（批號100333-200201）、氫化可的松（批號 100152-200206）、地塞米松 （批號 100129-200804）、潑尼松（批號100199-201002）、潑尼松龍（批號100153-201004）、倍他米松（批號100118-200403），中國藥品生物制品檢定所提供；正己烷、丙酮、乙腈為質譜純，德國Merck公司提供；水為超純水，屈臣氏公司提供。

1.3 樣品的制備

（1） 提取。稱取樣品2 g置50 mL離心管中，加入乙酸乙酯10 mL，渦旋提取3 min，然后以轉速10 000 r/min離心10 min，取全部上清液。重復上述提取1次，合并乙酸乙酯層，于45℃下平行蒸發至近干。用乙酸乙酯-正己烷（1∶5）溶解殘渣，待凈化。

（2）凈化。取待凈化液過柱，用5 mL正己烷淋洗固相萃取柱，抽干，用正己烷-丙酮6/4洗脫，45℃氮氣吹干，用初始梯度流動相1 mL溶解，過0.22 μm濾膜，進樣。

1.4 標準溶液的制備

取6種糖皮質激素分別配制成質量濃度為10，20，50，100，200 ng/mL的標準曲線溶液。分別以每種物質的峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.5 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流速0.40 mL/min；柱溫40℃；進樣量5 μL。

流動相A：5 mmol/L甲酸銨；流動相B：乙腈。

6種糖皮質激素分離的流動相梯度見表1。

表1 6種糖皮質激素分離的流動相梯度

1.6 質譜條件

電噴霧電離元（ESI）、負離子掃描、多反應監測（MRM） 模式、毛細管電壓3.00 kV；錐孔電壓30 V；脫溶劑氣體溫度350℃；脫溶劑氣體流量700 L/Hr；錐孔氣體流速150 L/Hr，在分析過程中以子母離子的保留時間和豐度比定性，以峰面積定量。

2 結果與討論

2.1 化合物的優化

糖皮質激素在電噴霧質譜中的準分子離子峰有[M+H+]、[M-H-]、[M+HCOO-]等多種形式。試驗采用50 ng/mL的標準品溶液，用流動注射泵連續進樣進行質譜條件的優化。分別在正離子（ESI+）和負離子（ESI-）模式下進行全掃描，結果表明6種物質在[M+HCOO-]模式下均具有較高的響應，因此選用負離子掃描方式，分別對6種物質進行一級質譜掃描，確定待測化合物的準分子離子峰，并分別優化錐孔電壓，通過氬氣碰撞產生子離子進行二級質譜掃描，并優化碰撞能量，選擇豐度較高的碎片離子作為定性與定量特征離子。

6種糖皮質激素質譜參數見表2。

表2 6種糖皮質激素質譜參數

2.2 色譜條件的優化

由于電噴霧質譜的電離是在溶液狀態下，因此流動相的組成會影響目標物的保留時間和峰型。當采用甲醇作為有機流動相時，倍他米松的響應值大大降低，且峰形拖尾，而選用酸溶液作為流動相時，在負離子模式下會抑制電離，因此選用甲酸銨和已經作為流動相。采用不同比例的流動相進行等度洗脫時，6種組分的靈敏度不理想，因此選用梯度洗脫。在梯度洗脫過程中，選擇含有90%的水相到含有90%的有機相的快速切換，有助于化合物快速洗脫，減少色譜峰的拖尾現象。

6種糖皮質激素分離色譜見圖1。

圖1 6種糖皮質激素分離色譜

2.3 方法學驗證

2.3.1 標準曲線與線性關系

采用優化后的色譜條件和質譜條件測得的系列標準工作溶液，分別以每種物質的峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。在10～200 ng/mL的線性范圍內，線性關系良好，相關系數均大于0.999。

6種糖皮質激素的標準曲線、相關系數及線性范圍見表3。

表3 6種糖皮質激素的標準曲線、相關系數及線性范圍

2.3.2 回收率、精密度及檢出限

用空白基質加標樣來計算6種糖皮質激素的回收率，共設置3個質量濃度梯度10，50，200 ng/mL，并計算測定結果的相對平均偏差反應結果的精密度。用10 ng/mL試樣進樣分析，計算6種物質的信噪比，分別按照S/N=3和S/N=10時6種糖皮質激素的濃度，確定檢出限及定量限。結果見表4，可知該方法具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

6種糖皮質激素的回收率、檢出限及定量限見表4。

表4 6種糖皮質激素的回收率、檢出限及定量限

3 結論

建立了肉類中的6種糖皮質激素測定的超高效液相色譜-串聯質譜的檢測方法，對市售的數10種禽畜類肉進行了測定，高效液相色譜-串聯質譜法具有簡單快捷、檢出限低等優點，而且能夠快速實現多種物質的色譜分離，可快速檢測肉類中的6種糖皮質激素，同時它將快速定性篩查和定量分析結合為一體，既能縮短檢測時間，又能節約人力成本，提高工作效率。

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