人源肺癌循環腫瘤細胞系在不同品系小鼠上肺轉移能力研究

闕祖俊，董昌盛，羅 斌，田建輝

(1上海中醫藥大學附屬龍華醫院,2上海市中醫藥研究院中醫腫瘤研究所,上海200032)

0 引言

肺癌是發病率和死亡人數增長最快,對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一［1－2］,而轉移是導致癌癥患者死亡的最主要原因［3］,針對早期肺癌術后患者進行及早干預進而預防肺癌轉移是提高總體生存期的關鍵［4］。研究肺癌的轉移機制進而阻斷肺癌的復發轉移對于提高臨床療效具有重要意義,因此,急需建立符合臨床病理實際發病特征的肺癌轉移模型。循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是指從原發灶或轉移灶脫落,在血液和淋巴管中循環的細胞［5］,它與肺癌的轉移具有十分密切的關系,在肺癌的預后、臨床分期及療效評價等方面具有重要意義［6－7］。以CTCs為靶點的藥物研發和治療策略的制訂很可能成為預防肺癌轉移的關鍵。故本實驗采用人源肺癌循環腫瘤細胞(CTC-TJH-01),通過在不同品系小鼠上建立尾靜脈注射肺轉移模型,為研究肺癌轉移機制及抗肺癌轉移藥物的篩選提供理想的動物模型。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑熒光倒置顯微鏡(DMI3000B),德國萊卡公司；CO2培養箱(STERI-CYCLE i160),美國Thermo公司；Eppendorf冷凍離心機(5804R),德國艾本德公司；F12K培養基,胎牛血清,胰蛋白酶,美國Gibco公司。

1.2 實驗動物和細胞C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠,雄性,體質量18～22 g,4～6周齡,各10只,購自并飼養于上海南方模式生物科技發展有限公司［生產許可證號:SCXK(滬)2014-0002；使用許可證號:SYXK(滬)2013-0035］。CTC-TJH-01細胞由課題組分離培養與建系。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養 將CTC-TJH-01細胞置于含10%胎牛血清的F12K完全培養基中,在37℃、50 mL/L CO2、70%濕度的恒溫細胞培養箱中培養、傳代,取對數生長期的細胞用于后續實驗［8］。

1.3.2 小鼠肺轉移模型的建立 將對數生長期的CTC-TJH-01細胞消化、計數,用0.9%的生理鹽水調整細胞濃度為1×107個/mL,通過尾靜脈注射100 μL的CTC-TJH-01細胞懸液接種于C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠體內,每組10只。

1.3.3 小鼠肺轉移情況觀察 CTC-TJH-01細胞接種于小鼠體內后,每隔兩周處死每組一只小鼠,取肺臟組織,在解剖學顯微鏡下觀察肺部成瘤情況,計算轉移灶數目。然后用中性福爾馬林固定,制作石蠟切片,進行H＆E染色,觀察肺臟組織及轉移灶情況。

1.3.4 病理組織切片檢查 處死小鼠后取出肺臟標本,浸泡于10%的中性福爾馬林中固定48 h,常規石蠟包埋切片,H＆E染色,染色切片于光學顯微鏡下觀察肺組織及轉移灶形態變化并拍照。

1.4 作圖分析實驗數據采用GraphPad Prism5和Adobe Photoshop CS4軟件進行作圖。

2 結果

2.1 CTC-TJH-01細胞在NOD/SCID小鼠上肺轉移率100%將CTC-TJH-01細胞通過尾靜脈注射接種于NOD/SCID小鼠體內后第8周,首次在小鼠肺臟發現轉移灶,在第10周將剩余小鼠全部處死,發現肺部成瘤率為100%(圖1A、1B)。通過對轉移灶進行H＆E染色發現腫瘤細胞排列緊密、細胞核較大且深染(圖1C、1D)。表明NOD/SCID小鼠可用于肺轉移模型的建立和抗轉移藥物的篩選。

圖1 CTC-TJH-01細胞在NOD/SCID小鼠上的肺轉移模型

2.2 CTC-TJH-01細胞在Nude小鼠肺部不成瘤將CTC-TJH-01細胞通過尾靜脈注射接種于Nude小鼠后,即使在第20周,在小鼠肺部仍未發現轉移灶(圖2)。其原因可能是Nude小鼠體內存在的B淋巴細胞和NK細胞對CTC-TJH-01細胞發生了排斥作用,清除了外周血中的CTCs,從而抑制了CTCs的轉移。

圖2 CTC-TJH-01細胞在Nude小鼠上的肺轉移模型

2.3 CTC-TJH-01細胞在C57BL/6小鼠肺部不成瘤將CTC-TJH-01細胞通過尾靜脈注射接種于C57BL/6小鼠,直到第20周,在小鼠的肺部均未發現轉移灶,由于免疫排斥作用,CTC-TJH-01細胞在C57BL/6小鼠上不具有肺轉移能力(圖3)。

圖3 CTC-TJH-01在C57BL/6小鼠上的肺轉移模型

3 討論

轉移是導致肺癌死亡的主要原因,而當前干預療效不佳的原因是臨床往往參考腫瘤原發灶病理用藥,而在轉移中起到關鍵作用的CTCs并未得到重視,因此肺癌早期預防轉移的干預并未體現精準醫學的指導理念。研究組前期發現早期肺癌患者即高表達CTCs［9］,并在IIa期女性肺腺癌患者外周血提取并建立了CTC-TJH-01細胞系［10］,采用外顯子測序分析,證實其來源于原發腫瘤［11］。初步發現與原代肺癌細胞系相比,該CTCs對紫杉醇和順鉑的耐藥性更強,初步提示了術后化療效果不佳的原因［12］。因此,體外抗轉移藥物的篩選應該以CTCs系為主開展,因為其表型已經發生改變,并與肺癌細胞系具有很大差異。然而,當前的人源腫瘤異種移植模型主要是建立的皮下移植瘤模型［13－16］,并不能用于抗轉移藥物的篩選,因此,急需建立符合臨床實際發病特征的肺癌轉移模型。

本課題組長期探索肺癌的臨床前動物模型的構建,認為模擬肺癌發病的實際病理過程和特征是成功與否的關鍵。本研究選用不同免疫背景的C57BL/6小鼠、Nude小鼠和NOD/SCID小鼠,在相同的實驗條件下采用尾靜脈注射將CTC-TJH-01細胞接種到小鼠體內,但由于小鼠品系、免疫背景和生理病理特點不同,其肺部成瘤率也存在很大差異。研究發現CTCTJH-01細胞在NOD/SCID小鼠上接種第10周后即可100%成瘤,而在 Nude小鼠和 C57BL/6小鼠上CTCs不成瘤。其可能的原因是人源肺癌循環腫瘤細胞具有較強的免疫原性,在小鼠體內激發了免疫排斥反應。因為C57BL/6小鼠為免疫功能正常小鼠,具有正常水平的T、B淋巴細胞和NK細胞；Nude小鼠由于無胸腺,故T淋巴細胞比例極低,但具有正常功能的B淋巴細胞和NK細胞,而NOD/SCID小鼠是聯合免疫缺陷小鼠,其體內表達極低的T、B淋巴細胞和NK細胞,因其免疫力更低,更容易接受異種移植。

本研究表明當小鼠體內存在B淋巴細胞和NK細胞時,對人源肺癌循環腫瘤細胞具有較強的排斥作用,可顯著抑制小鼠肺部成瘤。Zahidunnabi等［17］研究也發現將人源乳腺癌細胞接種到NOD/SCID小鼠體內,并同時接種NK細胞后可顯著抑制乳腺癌的生長和轉移。此外,Vikis等［18］研究發現腫瘤細胞在不同品系小鼠上的生長和轉移差異與T細胞的功能相關。因此,在建立人源循環腫瘤細胞肺轉移模型的實驗研究中,NOD/SCID小鼠可滿足實驗研究所需的條件,是較為理想的動物模型。本研究初步確立了CTCs尾靜脈注射后的成瘤時間和干預節點,并提出成瘤率可以作為轉移干預的療效評價指標。

本研究采用人源肺癌循環腫瘤細胞系建立的肺癌轉移模型,其目的是盡可能模擬臨床發病的實際情況,為篩選抗轉移藥物提供工具,但也存在仍待完善之處。首先,該模型未能體現人體免疫系統與腫瘤之間的相互作用,因此也不能用于抗轉移免疫治療藥物的研發,但可用于DC-CIK或CAR-T等細胞免疫治療研究。其次,由于CTCs的異質性問題,篩選抗轉移藥物的過程中未必能夠精準靶向真正引起轉移發生的CTCs亞群細胞,這也是目前該領域的主要瓶頸。最后,由于個體差異和肺癌患者接受不同的治療,CTCs細胞系存在著不同的突變基因和表型,單一CTCs細胞株不能滿足于研發針對CTCs的靶向藥物。

綜上所述,本研究表明不同遺傳背景的小鼠可顯著影響人源肺癌循環腫瘤細胞的轉移,而將CTCs通過尾靜脈注射接種到NOD/SCID小鼠體內,能夠建立肺癌轉移動物模型,且動物肺部成瘤時間較長,可為研究肺癌轉移機制和抗轉移藥物的篩選提供較好的實驗平臺。

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