抑制microRNA-202-3p表達促進滑膜間充質干細胞軟骨分化

張 聘，張林香，趙建寧，張 雷

［1南京醫科大學金陵臨床醫學院(解放軍南京總醫院)骨科,2解放軍南京總醫院麻醉科,3解放軍南京總醫院骨科,江蘇 南京210002］

0 引言

滑膜間充質干細胞(synovium-derived mesenchymal stem cells,SMSCs)可以從正常或骨關節炎滑膜組織中獲得［1］,具有良好的多項分化潛能,相較于其他間充質干細胞成軟骨分化能力更強［2］,并且滑膜組織再生能力強,臨床上取材方便,目前被廣泛用于軟骨組織工程中。

MicroRNA(miRNA)是一類長約22 nt的內源性非編碼單鏈小RNA,主要通過參與基因的轉錄后調控實現對靶基因的表達調節,其在腫瘤發生發展、生物發育、器官形成、表觀調控及代謝等方面發揮極其重要的調控作用。已有大量研究［3－4］表明miRNA參與調控間充質干細胞成軟骨分化。在既往關于miR-202-3p的研究中,Zhou等［5］通過熒光素酶報告基因實驗發現基質金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP1)是miR-202-3p的直接靶點,MMP與其特異性組織抑制因子之間的失衡是骨關節炎(osteoarthritis,OA)軟骨降解的重要原因之一。Wainwright等［6］發現pri-miR-202可能是Sox9基因的一個直接轉錄靶點。Zhang等［7］發現miR-202能夠通過互補配對結合Sox6 3'-UTR從而調控Sox6基因表達,Sox6、Sox9基因在軟骨分化過程中都發揮著重要的調控作用。課題組利用microRNA基因芯片技術檢測長鏈非編碼RNA DANCR誘導滑膜間充質干細胞成軟骨分化過程中miRNA的表達情況,篩選出在分化不同時期表達明顯差異的miRNA［8］,其中miR-202-3p在誘導分化后期表達明顯降低。綜合以上研究結果,推測miR-202-3p可能在軟骨細胞代謝及分化過程中發揮重要作用。

基于以上研究背景,實驗構建miR-202-3p抑制劑表達載體轉染人SMSCs,觀察其對SMSCs增殖以及成軟骨分化的影響。

1 材料和方法

1.1 設計細胞體外觀察性實驗。

1.2 時間及地點實驗于2016年11月至2017年11月在解放軍南京總醫院完成。

1.3 材料滑膜組織:選擇在解放軍南京總醫院住院并進行全膝關節置換的膝關節骨關節炎患者10例,其中男5例,女5例,平均年齡65歲,術中獲取需要切除的膝關節髕上囊部位滑膜組織。研究開始前均取得患者同意并簽署知情同意書。研究內容經解放軍南京總醫院倫理部門審核并批準。

主要試劑及儀器:miR-202-3p inbibitor及其對照inhibitor-NC由江蘇凱基生物技術股份有限公司合成；間充質干細胞基礎培養基和成軟骨誘導分化完全培養基(廣州賽業公司)；胎牛血清(Gibco公司)；Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；甲苯胺藍(成都貝斯特試劑有限公司)；TRIzol(Invitrogen)；cDNA第一鏈合成試劑盒(美國 Thermo Fisher K1622)；倒置相差顯微鏡(Nikon TMS顯微鏡)。

1.4 實驗方法

1.4.1 SMSCs的分離和培養 獲取行膝關節置換手術患者的滑膜,按照 Pei等［9］的方法分離滑膜干細胞。取術中切除的髕上囊部位的滑膜,無菌條件下轉移至超凈工作臺,PBS沖洗3次。剪除多余的脂肪和結締組織,分離出平滑光亮的滑膜組織,將其剪碎至1 mm3大小。加入0.2%濃度的Ⅱ型膠原酶在37℃、5%CO2的培養箱內消化4 h。經120目尼龍網過濾,濾液移至離心管,1000 rpm離心10 min棄去上清液。以1×104個有核細胞平鋪于25 cm2培養瓶中,在基礎培養基(HG-DMEM、10%胎牛血清、1%青霉素+鏈霉素)中培養。24 h后換液棄去未貼壁的細胞,此時獲得原代SMSCs,繼續培養,待細胞鋪滿80%時,以1∶3進行傳代培養。第3代細胞即為人SMSCs。

1.4.2 SMSCs的鑒定 采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原。取第3代貼壁SMSCs,0.25%胰酶消化重懸至1.5×106/mL,各管分別加入單克隆抗體 CD44、CD90、CD45、CD34,同時每管樣品設立同型陰性對照。室溫避光孵育45 min,用PBS洗去未結合抗體,重懸細胞,流式細胞儀進行檢測分析。

1.4.3 質粒轉染 取第3代貼壁SMSCs,細胞密度達到80%時,加入1 mL培養基。將Lipo2000和miRNA-202-3p inhibitor混勻,室溫孵育20 min,然后將miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液加入含細胞的培養基中,37℃、5%CO2的培養箱中培養6 h后,將含有miRNA-202-3p inhibitor-lipo2000混合液的培養基移去,更換新鮮基礎培養基,繼續培養48 h。同樣方法轉染miRNA-202-3p inhibitor NC,設為對照組。qRT-PCR檢測miR-202-3p表達水平。

1.4.4 CCK-8檢測 細胞消化、計數、配制成濃度為3×104/mL的細胞懸液,96孔板中每孔加入100 μL細胞懸液,將96孔板置于37℃、5%CO2的培養箱中分別培養1、2、3、4、5、6、7 d,將96 孔板進行CCK-8 染色,λ＝450 nm,測定OD值,繪制細胞生長曲線。

1.4.5 微團培養誘導SMSCs軟骨分化 分別取inhibitor組、NC組的 SMSCs,按照 7.5×105/mL的密度重懸,吸取0.5 mL細胞懸液轉移至15 mL離心管中,置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。當細胞團出現聚攏現象時,輕彈離心管使其懸浮于液體中。每3天更換1次培養基,每管約0.5 mL軟骨誘導培養基,持續培養21 d。

1.4.6 組織學檢測 采用堿性甲苯胺藍染色方法鑒定軟骨細胞。自然晾干細胞樣本,浸入4%的多聚甲醛固定液中30 min,PBS浸洗3次,0.1%堿性甲苯胺藍液浸染30 min,水洗,入冰醋酸液分化,直至胞核和顆粒清晰,風干,中性樹膠封片,顯微鏡觀察。

1.4.7 qRT-PCR檢測 收集各組成軟骨誘導培養21 d的細胞團,使用TRIzol試劑提取各組總RNA,通過cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄合成cDNA,將cDNA樣品配置Real-time PCR反應體系:SYRB Green PCR Master Mix 10 μL,cDNA 模板 1 μL,上游和下游引物各 1 μL,0.1%DEPC 水 7 μL,總體積 20 μL。 置于Real-time PCR儀上進行PCR反應。檢測軟骨細胞特異性基因Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的表達,NC組的細胞作為陰性對照,以GAPDH為內參照(表1)。

表1 引物序列

1.5 觀察指標轉染miR-202-3p抑制劑后,對人SMSCs增殖的影響；轉染miR-202-3p抑制劑后,對誘導人SMSCs成軟骨分化相關基因(Ⅱ型膠原、蛋白聚糖、Sox9)表達的影響。

1.6 統計學處理實驗結果用SPSS17.0軟件進行分析,兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗,數據以±s表示,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SMSCs細胞形態學觀察SMSCs接種48 h后開始貼壁生長,顯微鏡下可見大量細胞,形態多樣,以多角形為主,細胞核位于細胞中心,細胞質呈放射狀向外突起(圖1A),隨著傳代次數增加,SMSCs趨向成形態單一的長梭形(圖1B),至第3代,鏡下可見大量按特定方向排列的形態一致的長梭形細胞(圖1C)。

圖1 SMSCs的形態(×200)

2.2 流式細胞儀檢測SMSCs表面抗原流式細胞檢測細胞表面抗原:CD44、CD90、CD45、CD34。 其中CD44、CD90 呈陽性表達(陽性率＞95%),CD45、CD34呈陰性表達(＜10%),與間充質干細胞特點相符(圖 2)。

圖2 流式細胞術鑒定結果

2.3 質粒轉染SMSCsqRT-PCR結果顯示轉染抑制劑組細胞中miR-202-3p表達明顯低于陰性對照組,表明轉染 miR-202-3p inhibitor后能有效沉默SMSCs中miR-202-3p的表達(圖3)。

圖3 qRT-PCR檢測SMSCs中miR-202-3p的表達水平

2.4 細胞增殖分析從轉染后第3天起,miR-202-3p inhibitor組的細胞增殖率明顯高于陰性對照組,這說明抑制SMSCs中的miR-202-3p可明顯提高SMSCs的增殖活性(圖4)。

圖4 連續培養7 d細胞增殖情況

2.5 甲苯胺藍染色結果成軟骨誘導21 d后,行甲苯胺藍染色,可見實驗組和陰性對照組細胞外基質均呈藍色,表明細胞外基質中有糖胺聚糖形成,符合軟骨細胞細胞外基質特征,miR-202-3p inhibitor組藍染更明顯,細胞數量更多(圖5)。

圖5 實驗組與對照組SMSCs成軟骨誘導后甲苯胺藍染色結果(×200)

2.6 軟骨細胞相關基因表達qRT-PCR結果顯示,實驗組軟骨細胞特異性基因(Ⅱ型膠原蛋白、蛋白多糖、Sox9)的表達明顯高于陰性對照組(圖6),說明抑制miR-202-3p表達能夠促進Ⅱ型膠原、蛋白多糖、Sox9的合成,對SMSCs的軟骨形成能力有促進作用。

圖6 qRT-PCR檢測SMSCs成軟骨誘導后軟骨特異性基因的表達

3 討論

創傷、骨關節炎等常引起關節軟骨缺損。由于軟骨組織缺乏血供、愈合能力差,成人關節軟骨缺損很難自我修復。SMSCs在既往研究中表現出良好的軟骨再生效果［10］。 Kondo 等［11］發現 SMSCs 有著與軟骨細胞相似的基因表達譜,說明二者可能來源于同一種前體細胞。相較于其他來源的間充質干細胞,SMSCs具有更強的成軟骨分化能力,目前是軟骨組織工程最主要的種子細胞。

本實驗室利用miRNA芯片檢測SMSCs成軟骨分化前后miRNA的表達譜,發現miR-202-3p表達明顯降低,并且miR-202-3p在多種細胞增殖過程中都起到抑制作用［12－15］,所以推測 miR-202-3p 可能為SMSCs軟骨分化的負調節因子。本研究結果表明,抑制miR-202-3p的表達能夠顯著促進SMSCs增殖,同時軟骨特異性基因的表達也顯著提高,證實了miR-202-3p與軟骨分化及修復有密切關系。

MiRNA主要通過結合目標mRNA的3'-UTR,誘導mRNA降解或抑制mRNA翻譯,從而調控目標基因的表達［16］。通過檢索 TargetScan數據庫發現miR-202-3p直接互補配對結合Sox6 3'-UTR的第2290-2296和6261-6267位點,保守互補序列分別為5'-ACAUUUCA-3'、5'-UACCUCA-3',并且 Zhang 等［7］的實驗證實miR-202負向調控Sox6的表達。Sox6和L-Sox5共同提高 Sox9的轉錄活性［17］。MiR-202-3p與Sox9無互補配對序列,Sox9不是miR-202-3p的直接靶目標。本實驗中抑制miR-202-3p表達后,可能提高了Sox6的表達,從而引起Sox9表達增加。而Col2A1是Sox9依賴性的軟骨細胞特異性增殖基因,Col2A1在軟骨細胞中的表達與Sox9呈正比關系,Col2A1的增高可能是由Sox9的增高引起的。

MiRNAs具有非常復雜的調控網絡,往往一個miRNA可以調控多種靶基因,而同一個靶基因也可以由很多miRNAs來進行調節。目前已經確認的miRNA在軟骨形成與分化過程中調控的靶點包括Sox 家族［18－19］、TGF-β 通路［8,20－21］、BMP 通路［22］、Wnt通路［3］、MAPK 通路［23］等。 Zhang 等［8］認為軟骨分化可能潛在地是由 TGF-β引起的,既往的研究［24－26］發現TGF-β1可通過多條信號通路參與間充質干細胞成軟骨分化過程,而且研究［27－28］發現 TGF-β1可以誘導miR-202表達。在SMSCs成軟骨分化中,miR-202-3p可能也受到TGF-β1調控,并且可能在多條通路中都發揮調控作用,具體的機制還有待進一步研究。

研究microRNA在軟骨細胞增殖、分化過程中的作用十分有意義,能夠為利用間充質干細胞和RNA干擾技術進行軟骨損傷修復及對骨關節炎的治療提供一定的理論基礎和實驗依據,我們期待干細胞和RNA技術給臨床治療軟骨缺損帶來新的突破。

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